عزل الحويصلات البكتيرية خارج الخلية باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم

خذ كروماتوغرافيا استبعاد الحجم أو عمود SEC مليء بخرز راتنج مسامي بحجم محدد. يحتوي على خزان عينة في الأعلى.

أضف محلول ملحي مخزن الفوسفات أو PBS لموازنة حبات العمود ، وتجاهل التدفق.

قم بتحميل مرشح مزرعة بكتيرية مركزة تحتوي على حويصلات خارج الخلية أو EVs وبروتينات مفرزة وملوثات.

المركبات الكهربائية عبارة عن حويصلات نانوية قائمة على الدهون تحمل جزيئات نشطة بيولوجيا وتفرزها البكتيريا.

بمجرد دخول المرشح إلى الخرزات ، أضف PBS لدفعه عبر سرير الراتنج.

تخلص من الملوث الأولي الذي يحتوي على ملوثات كبيرة غير حويصلية.

ضع أنبوب تجميع أسفل المخرج وأضف PBS بالتتابع.

تتهرب المركبات الكهربائية كبيرة الحجم من مسام الراتنج الأصغر ، وتتحرك عبر المساحات بين الجسيمات بين الخرزات ، وتملغ أولا.

تدخل البروتينات والملوثات الأصغر إلى المسام ، وتتبع مسارات أطول ، وتتساقط لاحقا.

اجمع الكسور الممسوة مبكرا التي تحتوي على المركبات الكهربائية وقم بتخزينها لتحليلها.

لعزل المركبات الكهربائية ، قم بإجراء كروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، أو SEC ، باستخدام عمود صغير بحجم سرير 10 ملليلتر لأقل من 100 مل من مواد البداية وعمود أكبر بحجم سرير 47 مليلتر لأكثر من 100 مل من مواد البداية. على مدار عدة ساعات قبل التجربة ، قم بإحضار عمود SEC و PBS إلى درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بتثبيت العمود في وضع رأسي باستخدام حامل وحامل مختبر قياسي. قبل الاتصال بعمود SEC ، قم بترطيب خزان العينة عن طريق السماح لخمسة ملليلتر من PBS بالتدفق عبر فريت إلى حاوية نفايات.

بعد ذلك ، قم بفك غطاء مدخل العمود لإضافة ملليلترين من PBS إلى خزان العينة وقم بتوصيل الخزان بعناية بالعمود حيث يتساقط PBS من خلال فريت. لتوازن العمود ، أضف 47 مليلترا من PBS إلى خزان العينة ، متبوعا بفك الغطاء السفلي من عمود SEC. بعد ذلك، اسمح لجميع المخزن المؤقت للعينة المحملة بالتدفق عبر العمود وتجاهل التدفق.

بعد تحميل ملليلترين من العينة على خزان العينة ، اسمح للعينة بالدخول إلى العمود بالكامل وتجميع التدفق. أضف PBS على الفور إلى خزان العينة بحجم 14.25 ملليلتر مطروحا منه حجم العينة للسماح للمحلول بالتدفق عبر العمود ، مع تجاهل الكمية التي تساوي حجم فراغ العمود. بعد ذلك ، ضع أنبوبا دقيقا منخفض الارتباط بملليلتر أسفل عمود SEC مباشرة لجمع أول تدفق أو جزء واحد بعد السماح لمليلترين من PBS بالمرور عبر العمود.

استمر في إضافة ملليلترين من PBS إلى خزان العينة لتجميع كل جزء لاحق. قم بتخزين الكسور المجمعة عند أربع درجات مئوية للتخزين قصير الأجل أو 80 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين على المدى الطويل.