تقييم ارتباط المكورات الرئوية بالخلايا البطانية البشرية الأولية تحت تدفق الوسائط المستمر

ضع شريحة قناة مطلية بالجيلاتين ، متصلة بمضخة ميكروفلوديك ، على مرحلة المجهر.

تحتوي الشريحة على خلايا بطانية بشرية أولية مزروعة تحت وسائط متدفقة ، مع خيوط من عامل فون ويلبراند أو VWF ، وهو بروتين سكري ، على سطح الخلية.

يتم إنشاء هذه الأوتار عن طريق تحفيز الخلايا بالهيستامين.

تدفق الوسائط المتحكم فيه ، المطبق من خلال مضخة الموائع الدقيقة ، يعزز إفراز VWF وفك اللف. هذا يعرض مجالات ربط محددة على سلاسل VWF.

أوقف تدفق الوسائط ، وأضف جسما مضادا متراكما بالفلوروفور الأخضر ، واستأنف التدفق لتسمية الأوتار بالجسم المضاد.

أوقف تدفق الوسائط مؤقتا وأدخل بكتيريا المكورات الرئوية المعبرة عن البروتين الفلوري الأحمر.

أعد تشغيل التدفق لتوزيع البكتيريا ، مما يتيح الارتباط بالمجالات المكشوفة من خلال الالتصاقات السطحية.

باستخدام الفحص المجهري الفلوري ، تصور الارتباط البكتيري في الوقت الفعلي بالسلاسل.

أوقف تدفق الوسائط واحصل على صور Z-stack لتحديد الارتباط البكتيري بالخلايا البطانية.

للتصور المجهري ، ضع الوحدة السائلة في غرفة التسخين بزاوية 37 درجة مئوية. ضع شريحة القناة على مسرح المجهر الدافئ مسبقا.

التحكم في مورفولوجيا الخلية وسلامة طبقة HUVEC قبل حقن الهيستامين والبكتيريا في الدورة الدموية. حافظ على إعداد التدفق. تحفيز إطلاق VWF من أجسام Palade البطانية القابلة للحياة عن طريق حقن 136 ميكرولتر من محلول مخزون الهيستامين 100 ملليمولار من خلال منفذ حقن في وسط ECGMS المتداول في أنبوب التروية.

للكشف عن التألق المناعي لسلاسل VWF متعددة الدمج ، قم بحقن 20 ميكروغراما من الجسم المضاد المقترن FITC الخاص ب VWF بحجم 200 ميكرولتر من PBS في 13.6 مل من وسط مخطط كهربية الجلوكوز. لتحديد ارتباط المكورات الرئوية بسلاسل VWF المتولدة على أسطح خلايا HUVEC ، قم بحقن 1.35 مرة 10 إلى الثامن CFU لكل مليلتر RFP للتعبير عن المكورات الرئوية بحجم أقصى يبلغ مليلتر واحد في وسط ECGMS باستخدام منفذ الحقن. حدد هدف غمر الزيت 63 مرة لتكبير المجهر واضبط إعدادات مرشح التألق في برنامج المجهر على قناة RFP باستخدام مرشح كشف 540 نانومتر للكشف عن RFP الذي يعبر عن المكورات الرئوية.

لتقدير الارتباط البكتيري بسلاسل VWF ، قم بإنشاء لقطات لمكدسات Z لما لا يقل عن 30 عرضا ميدانيا تمثيليا يحتوي كل منها على ما يقرب من 10 HUVEC سليمة شكليا واحسب كمية المكورات الرئوية.