تقييم الوفيات الناجمة عن البكتيريا المسببة للأمراض في يرقات C. ايليجانس

ابدأ ببكتيريا مسببة للأمراض مزروعة على أجار.

اكشط البكتيريا ، وعلقها في مخزن مؤقت ، وأضف وسيطا للحفاظ على بقاء البكتيريا.

استغني عن التعليق في صفيحة دقيقة.

بعد ذلك ، خذ سلالات منفصلة من يرقات C. ايليجانس ، إما مع زيادة القابلية لمسببات الأمراض أو مع مقاومة معززة ، واسمح لها بالاستقرار.

قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق اليرقات في وسط جديد ، وانقلها إلى الصفيحة الدقيقة التي تحتوي على البكتيريا.

أغلق الصفيحة الدقيقة بغشاء نفاذ للغاز واحتضانها. تفرز البكتيريا مستقلبات سامة تنشط مسارات الإجهاد وتؤدي إلى موت الخلايا.

اغسل الآبار للقضاء على البكتيريا ، وأضف صبغة فلورية غير منفذة للخلايا ، واحتضنها.

تخترق الصبغة فقط خلايا اليرقات الميتة ذات الأغشية المعطلة وترتبط بأحماضها النووية.

اغسل لإزالة الصبغة الزائدة وقم بتصوير الديدان الملطخة بالفلورسنت لتقييم معدل الوفيات في السلالات الحساسة والمقاومة.

لإجراء مقايسة قتل السوائل ، استخدم مكشطة خلية لإزالة P. aeruginosa من لوحة SK وإعادة تعليق البكتيريا في حوالي 5 ملليلتر من S Basal.

باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، قم بقياس OD 600 من المعلق البكتيري. قم بإعداد 24 مل من المخزون المخفف من P. aeruginosa في S Basal عند OD 600 يساوي 0.09 ، ثم أضف 21 مل من وسائط SK السائلة ، وباستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بنقل 45 ميكرولتر من البكتيريا والوسائط إلى كل بئر من صفيحة بئر 384. اغسل الديدان من مصدرها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، واسمح لها بالاستقرار تحت قوة الجاذبية.

قم بشفط المادة الطافية إلى 5 ملليلتر، ثم استخدم ما مجموعه 50 مل من S Basal لتعليق الديدان، وكرر الغسيل مرتين أخريين. باستخدام آلة فرز الدودة ، قم بفرز ما يقرب من 22 ديدان في كل بئر من صفيحة 384 بئر ، وفقا لبروتوكول النص ، ثم استخدم طبقة نفاذة للغاز لإغلاق اللوحة واحتضانها عند 25 درجة مئوية لمدة 24 إلى 48 ساعة. في الوقت المطلوب ، استخدم غسالة صفيحة صغيرة و S Basal لغسل لوحة البئر 384 ما مجموعه 5 مرات.

أحد أسهل الأخطاء التي يمكن ارتكابها هو شفط صفيحة البئر 384 قبل أن تستقر الديدان تماما. يتطلب الأمر ممارسة لتتمكن من معرفة ما إذا كانت الديدان قد استقرت تماما بدقة. بعد الغسيل النهائي ، قم بشفط المادة الطافية حتى 20 ميكرولترا.

ثم أضف 50 ميكرولتر من صبغة الحمض النووي 0.98 ميكرومولار لكل بئر، للحصول على تركيز نهائي قدره 0.7 ميكرومولار. احتضن الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 إلى 16 ساعة. بعد فترة الحضانة المطلوبة ، استخدم غسالة الألواح الدقيقة لغسل الألواح ثلاث مرات على الأقل.

للحصول على البيانات ، استخدم مقياس الطيف الضوئي أو المجهر الآلي لتصوير كل من الضوء المنقول والفلورة.