التنقية الانتقائية للبروتين البكتيري عن طريق كروماتوغرافيا التبادل الأيوني السالب

ابدأ بمحلول راتنج التبادل الأيوني يحتوي على مجموعات وظيفية موجبة الشحنة لربط البروتين الانتقائي.

بعد ذلك ، خذ مستخلص بروتين تم الحصول عليه من الخلايا البكتيرية المضيفة المصممة للإفراط في التعبير عن عامل الفوعة من البكتيريا المسببة للأمراض هيليكوباكتر بيلوري.

يحتوي المستخلص على عامل الضراوة المستهدف جنبا إلى جنب مع بروتينات الخلية المضيفة في مخزن مؤقت عند درجة الحموضة 8.

امزج مستخلص البروتين مع الراتنج واحتضنه بالتحريض لضمان تفاعل موحد بين البروتين والراتنج.

تصبح البروتينات المضيفة ، التي تحتوي على نقاط متساوية الكهربية أقل من درجة الحموضة العازلة ، سالبة الشحنة وترتبط بالراتنج موجب الشحنة.

يظل البروتين المستهدف ، مع نقطة متساوية الكهربية بالقرب من درجة الحموضة العازلة ، غير مشحون إلى حد كبير ويبقى غير مرتبط.

انقل ملاط البروتين والراتنج إلى عمود كروماتوغرافيا واسمح للراتنج بالاستقرار.

اجمع المرحلة السائلة التي تحتوي على البروتين المستهدف غير المرتبط.

اشطف الراتنج بالمخزن المؤقت لضمان أقصى استرداد للبروتين المستهدف.

لتحضير 15 مل من راتنج DEAE ، قم بتعليق 0.6 جرام من المسحوق الجاف لراتنج DEAE في 30 مل من المخزن المؤقت Tris-HCl في درجة حرارة الغرفة لمدة يوم واحد على الأقل.

قم بالطرد المركزي للراتنج عند 10,000 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة ثم قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها. ثم أضف 15 مل من المخزن المؤقت Tris-HCl. بعد تكرار الطرد المركزي ، قم بإعادة التعليق أربع مرات أخرى ، وقم بتخزين 15 مل من الراتنج المستقر عند أربع درجات مئوية للاستخدام لاحقا.

العمل على أربع درجات مئوية ، أضف 45 مل من البروتينات القابلة للذوبان المحضرة إلى 15 مل من الراتنج وانقله إلى دورق 100 مل مع قضيب التحريك. قلب ملاط راتنج البروتين باستخدام طبق تحريك على أربع درجات مئوية لمدة ساعة. بعد ذلك ، صب ملاط راتنج البروتين في عمود بلاستيكي أو زجاجي مزود بمحبس واترك الراتنج يستقر تحت الجاذبية.

افتح محبس للسماح لمحلول البروتين بالمرور عبر العمود عن طريق تدفق الجاذبية حتى يكون مستوى السائل في العمود أعلى من الراتنج مباشرة. اجمع التدفق من خلال الجزء غير المرتبط الذي يحتوي على البروتين المنشط للعدلات المنقى. أضف 15 ملليلترا من المخزن المؤقت Tris-HCl المثلج إلى العمود.

افتح محبس المخزن مرة أخرى للسماح لمخزن الغسيل المؤقت بالمرور عبر العمود عن طريق تدفق الجاذبية حتى يصبح مستوى السائل في العمود فوق الراتنج مباشرة. اجمع التدفق من خلال جزء الغسيل. كرر الغسيل باستخدام المخزن المؤقت المثلج أربع مرات أخرى لجمع أجزاء الغسيل الإضافية.