تحضير وتحويل البكتيريا باستخدام التثقيب الكهربائي عالي الجهد

ابدأ بأنبوب يحتوي على بكتيريا ملقحة في وسط مغذي.

احتضان مع الاهتزاز حتى تصل الخلايا إلى مرحلة الانقسام النشط.

جهاز طرد مركزي لجمع الخلايا والتخلص من الطافية.

اغسل الخلايا بشكل متكرر باستخدام الجلسرين المثلج لإزالة الأملاح وإعادة تعليقها في الجلسرين للحفاظ على بقاء الخلية.

قم بإعداد بلازميد يحتوي على جين مقاوم للمضادات الحيوية في مياه معقمة باستخدام EDTA لمنع تدهور الحمض النووي.

امزج محلول البلازميد مع الخلايا البكتيرية.

ضع نبضة قصيرة عالية الجهد لإنشاء مسام مؤقتا في الغشاء البكتيري.

هذا يسمح للحمض النووي البلازميد بدخول السيتوبلازم.

انقل الخلايا على الفور إلى وسط الاسترداد واحتضان مع الاهتزاز.

تدعم مكونات الوسيط إصلاح الغشاء والتعبير الجيني لمقاومة المضادات الحيوية المشفر بالبلازميد.

انشر الخلايا على أجار المغذيات التي تحتوي على المضاد الحيوي واحتضان حتى تتشكل المستعمرات.

اختر مستعمرة واحدة وقم بوضعها على طبق جديد لتنقية المحولات.

لبدء التجربة ، قم بإعداد الخلايا ذات الكفاءة الكهربائية لأعلى 10 سلالات بكتريا قولونية .

نقل مستعمرة واحدة إلى ملليلتر واحد من وسائط LB. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية أثناء الرج عند 180 دورة في الدقيقة. قم بتخفيف ما قبل الاستزراع من واحد إلى 500 في 25 مل من وسائط LB الطازجة واحتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية حتى تصل إلى المرحلة اللوغاريتمية 0.6 OD. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 5,000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة.

بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الحبيبات في 25 مل من حجم 10٪ لكل حجم ، ماء جلسرين معقم مثلج ، وكرر هذه الخطوة أربع مرات ، مع الحصول على حجم إعادة التعليق في كل مرة حتى يتم الوصول إلى 1.5 مل.

بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في 10٪ جلسرين وقسم تعليق الخلية إلى 50 ميكرولتر من الحصات. قم بتخزين النقاط عند سالب 80 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر. لمواصلة التجربة ، قم بإذابة البلازميد المطلوب في ماء معقم مكمل ب 0.5 ملليمولار EDTA ، وقم بإذابة جزء من الخلايا الكهربية على الجليد.

أضف 2.5 إلى 5 نانوجرام من المتجه واخلط الخلايا المذابة. وزع الخلايا في كوفيت 0.1 سم. ضع نبضة 1.8 كيلو فولت على الخلايا ، وانقل الخلايا الكهربائية على الفور إلى مليلتر واحد من وسائط SOC.

احتضان الخلايا أثناء الرج لمدة ساعة ، وانقل 100 ميكرولتر إلى أطباق بتري تحتوي على أجار LB والمضادات الحيوية ، واحتضن الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية. قم بتنقية المحولات عن طريق وضع مستعمرات مفردة على أطباق بتر.