تقييم تكرار الطفرات في البكتيريا باستخدام مقايسة بيتا جلوكوزيداز

خذ ثقافة من البكتيريا المعدلة وراثيا.

يتم تحفيز البكتيريا للتعبير عن متغير متحور من بوليميراز الحمض النووي مع نشاط تدقيق معيب ، مما يزيد من فرص حدوث خطأ في النسخ المتماثل.

يمكن أن تؤدي هذه الأخطاء إلى طفرات تلقائية في المنطقة التنظيمية ، مما يؤدي إلى قمع جين بيتا جلوكوزيداز ويؤدي إلى التعبير عن إنزيم بيتا جلوكوزيديز.

اجمع العينات على فترات زمنية منتظمة وقم بتقييم عدد الأجيال البكتيرية في كل مزرعة. قم بالطرد المركزي للعينات وتخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق الحبيبات في مخزن مؤقت.

أضف محلول نفاذية واخلطه لتخلاذ الغشاء البكتيري.

انقل العينات البكتيرية المنفذة إلى صفيحة متعددة الآبار.

أضف ركيزة تدخل البكتيريا وتتفاعل مع إنزيم بيتا جلوكوزيداز ، مما ينتج عنه منتج ملون.

قم بقياس شدة اللون لتحديد نشاط بيتا جلوكوزيديز.

تحليل نشاط بيتا جلوكوزيداز في الثقافات البكتيرية لتحديد تواتر الطفرات عبر الأجيال.

انقل مستعمرة واحدة من الإشريكية القولونية TOP10 تحتوي على ناقلات pBAD-ε و pGOOD1-εD12A11 إلى مليلتر واحد من وسائط LB المعالجة بالمضادات الحيوية.

احتضن المزرعة طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي ، قم بتخفيف ما قبل الاستزراع من 1 إلى 250 في ثلاث قوارير تحتوي على 10 ملليلتر من الوسائط الطازجة. أضف المحرضات مليمولار لكل من الأرابينوز أو IPTG أو الأرابينوز و IPTG ، واحتضان المزرعة المستحثة عند 37 درجة مئوية لمدة ثماني ساعات.

تحضير الثقافات غير المستحثة بالتوازي. اجمع مليلتر واحد وقم بتخفيفها من واحد إلى 500 في قوارير جديدة تحتوي على 10 ملليلتر من الوسائط الطازجة ، مكملة أو غير مكملة بمحفزات. ثم احتضن الخليط طوال الليل على حرارة 37 درجة مئوية.

في اليوم التالي ، كرر الخطوات التي تبدأ بتخفيف الثقافة المسبقة واجمع ملليلتر واحد. ثم توضع الحصص في الفريزر.

بعد ذلك ، حدد عدد الأجيال التي حدثت في كل ثقافة. نقل 100 ميكرولتر من التخفيفات التسلسلية المناسبة للتلقيح والمزرعة على ألواح LB.

احتضن الأطباق طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي ، عد المستعمرات على لوحات LB.

احسب سجل عدد الخلايا الموجودة في اللقاح أو السجل I وفي المزرعة في نهاية النمو أو السجل C ، وحدد عدد الأجيال.

ثم قم بالطرد المركزي للثقافة عند 5,000 جرام لمدة 20 دقيقة وأعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من 50 ملليمولار تريس هيدروكلورايد كلوريد ، درجة الحموضة 7.6 ، 50 ملليمولار كلوريد الصوديوم.

لتخلاذ الخلايا ، أضف قطرتين إلى ثلاث قطرات من الكلوروفورم والدوامة لمدة 20 ثانية.

أخيرا ، حدد نشاط الجلوكوزيداز لكل حصة في صفيحة دقيقة مكونة من 96 بئرا.

أضف 100 ميكرولتر من الخلايا المنفذة و 100 ميكرولتر من استخدام ركيزة p-nitrophenyl-D-glucopyranoside إلى كل بئر ، مع تجنب تكوين فقاعات الهواء في الآبار.

اقرأ الامتصاص عند 420 نانومتر باستخدام قارئ ومرشح صفيحة دقيقة.