موسوعة JoVE للتجارب
Microbiology
0 مشاهدة • 2:54 دقيقة • November 28th, 2025
خذ معلقا من خلايا بكتيرية تعبر عن بروتين مستهدف محمل علامة بولي هيستيدين.
سونيكيت على الثلج لتقليل تحلل البروتين. تقوم الموجات الصوتية عالية التردد بتحليل الخلايا، مطلقة محتويات داخل الخلية، بما في ذلك البروتين المستهدف.
يقوم بالطرد المركزي لفصل الحطام ونقل البروتينات التي تحتوي على المادة الفائقة إلى حقنة.
قم بتصفية المادة الفائقة لإزالة التجمعات ومنع انسداد عمود الكروماتوغرافيا.
خذ عمود كروماتوغرافيا الألفة المعتمد على النيكل ووازنه لتحقيق تنقية بروتينية مثالية.
حمل الفلترة على العمود. ترتبط وسم البوليهيستيدين بأيونات النيكل على راتنج العمود، مما يثبط حركة البروتينات المستهدفة.
اغسل العمود باستخدام حاجز لإزالة البروتينات غير المرتبطة، وراقب امتصاص الأشعة فوق البنفسجية للبروتينات غير المستهدفة للتأكد من إزالتها للبروتينات غير المستهدفة.
أضف محلول إخلاء يحتوي على إيميدازول، الذي ينافس وسم البوليهيستيدين في ارتباط النيكل، مما يطلق البروتينات.
تؤكد الزيادة الثانية في امتصاص الأشعة فوق البنفسجية استساب البروتين المستهدف، الذي يكون جاهزا للاستخدام في المراحل التالية.
قم بسونيك الخلايا على الجليد باستخدام خمس دورات من نبضة مدتها 15 ثانية وتوقف لمدة 30 ثانية.
بعد تعقيد محلل الخلية عند 21,000 جرام وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة، قم بترشيح المادة الفائقة باستخدام نظام فلتر معقم. استخدم نظام تنقية آلي، مزود بعمود ألفة قائم على النيكل بسعة خمسة مليليتر لتنقية الجزء المعتمد على RTA الموسوم ب HIS من الفائق التابع للإشريكية القولونية المعقمة. بشكل عام، استخدم سرعة إخراج ملليلتر واحد في الدقيقة وبرد نظام التنقية بالكامل لمنع ارتباط السموم بشكل غير فعال وفقدان نشاط السموم.
قم بتعديل عمود الألفة لفترة وجيزة باستخدام 20 ملليلتر من مخزن الربط لإزالة مخزن التخزين. ثم يضع المادة المعقمة والمصفى على عمود الألفة باستخدام حقنة. اغسل العمود ب 25 إلى 35 ملليلتر من محلول الارتباط لإزالة البروتينات غير المرتبطة من العمود.
قم بخطوة الغسيل حتى يقترب امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر من القيمة الأولية للأشعة فوق البنفسجية. ثم قم بإخراج الجزء المرتبط من RTA بسعة 20 إلى 35 ملليلتر من مخزن الإزالة وحافظ على العينة على التجمد. من المهم بدء أخذ عينات نسبة RTA بعد فترة قصيرة من زيادة قيمة UV 280 وإيقاف أخذ عينات نسبة RTA عندما يصل إلى الأساس الأصلي مرة أخرى.