نقل نظام تعبير جيني محفز إلى خلايا تعبر عن بروتين مؤثر بكتيري

اختبر الخلايا البشرية التي تعبر عن CaeB، وهو بروتين بكتيري مضاد للاستماتة.

استخدم الخلايا التي تفتقر إلى CaeB كوسيلة تحكم.

تقديم كاشف ترانسفيكشن مركب مع نظام تعبير جيني محفز بالتتراسيكلين يحتوي على بلازميدات منظم واستجابة.

يقوم المنظم بتشفير منشط نسخ وكتم صوت، بينما يشفر بلازميد الاستجابة بروتين مؤيد الاستعباد يتحكم فيه TRE.

حضن الخلايا لتسهيل امتصاص البلازميدات والتعبير التنظيمي عن البروتين.

بدون التتراسايكلين، يبقى المنشط غير نشط، ويقوم كاتم الصوت بكبح النسخ المدفوع ب TRE.

أضف نظيرا للتتراسيكلين واحتضن.

يتيح النظير ارتباط المنشط مع TRE، مما يبدأ التعبير عن بروتين بروبروتي.

في الخلايا الضابطة، يحفز هذا إشارات الاستماتة، مما ينشط علامة الاستماتة.

في الخلايا المعبرة عن CaeB، يثبط CaeB الإشارات المبوتة، مما يقلل من تنشيط العلامة.

يشير انخفاض تنشيط المؤشرات في الخلايا المعبرة عن CaeB إلى أن CaeB يثبط الاستماتة المبرمجة.

ابدأ هذا الإجراء بزرع خلايا HEK293 تعبر بشكل مستقر عن GFP أو GFP-CaeB في صفيحة مكونة من 12 بئر بكثافة 100,000 خلية في كل بئر.

بعد ذلك، جهز الحمض النووي وكاشف نقل البولي إيثيلينامين بشكل منفصل في 75 ميكرولتر من وسط أوبتي-ميم، وحضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. للتكوين المعقد، حضن كلا الخليطين معا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أضف محلول البولي إيثيلينامين النووي بشكل قطري إلى الخلايا وحضن عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد خمس ساعات من النقل الدماغي، تحفز التعبير عن بروتينات الموتمة الزائدة عن طريق إضافة ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من دوكسيسيكلين إلى وسط الزراعة. ثم حضن الخلايا لمدة 18 ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون.