التصوير عالي الإنتاجية لعدوى البروسيلا الإجهاضية داخل الخلايا في خلايا ظهاري المضيف

ابدأ بالخلايا الظهارية التي تم فيها تقليل تعبير بروتين مكيف الإنترفيرون، وهو وسيط رئيسي للمناعة الفطرية، مما يجعل الخلايا أكثر عرضة لعدوى بروسيلا .

استبدل الوسط بوسط عدوى يحتوي على بروسيلا أبورتوس (بروسيلا أبورتوس) البروتين الفلوري الأخضر المعبر، وهو ممرض داخلي اختياري، بالتركيز المطلوب.

يقوم بالطرد المركزي في الصفيحة لتعزيز الاتصال بين البكتيريا وخلايا المضيف، ثم يحتضن للسماح باستيعاب البكتيريا.

اغسل الخلايا بوسط يحتوي على المصل، وعالجها بمضاد حيوي للقضاء على البكتيريا خارج الخلية.

حضن أكثر للسماح للبروسيللا بالتكاثر داخل الخلية.

اغسل الخلايا بالمحلول المؤقت وتثبيتها بالبارافورمالديهايد للحفاظ على الهياكل داخل الخلية.

اشطف المثبت الزائد. ثم أضف محلول مغذي بالمنظفات لنفير الخلايا.

اغسل المنظف المتبقي، ثم أضف DAPI لتلوين النوى، وقم بغسل نهائي.

باستخدام المجهر الآلي، احصل على صور عالية الإنتاجية لعدوى بروسيلا في خلايا الظهارة المضيفة.

باستخدام غسالة ألواح آلية، استبدل وسط النقل ب 50 ميكرولتر من وسط العدوى. داخل الغطاء، انقل اللوح إلى قفص الطرد المركزي وقم بطرد مركزي بلوحة 384 بئر عند 400 مرة في الجرام وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.

ثم استخدم بارافيلم لإغلاق اللوح وحضنه على لوح ألمنيوم مسخن مسبقا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون_لمدة أربع ساعات. بعد الحضانة باستخدام غسالة الألواح الآلية، استخدم DMEM مع 10٪ ألياف الألياف الصلبة (FCS) تحتوي على 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من جينتاميسين أو GM لغسل الخلايا لتعطيل البكتيريا خارج الخلية. ثم استخدم البارافيلم لإغلاق اللوح ووضعه مرة أخرى على لوح الألمنيوم المسخن مسبقا في الحاضنة لمدة 40 ساعة أخرى لإجراء اختبار النهاية.

لإصلاح الخلايا، استخدم أولا PBS لغسل الآبار. ثم استبدل PBS ب 50 ميكرولتر من 3.7٪ PFA في HEPES 0.2 مولر عند pH 7.4 وحضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

بعد الحضانة، استخدم 50 ميكرولتر من PBS لتبادل وسط التثبيت. لصبغ العينات بغسالة الألواح الآلية، ابدأ باستخدام 50 ميكرولتر من 0.1٪ Triton X-100 في PBS لمدة 10 دقائق لاختراق الخلايا.

بعد استخدام PBS لغسل الخلايا ثلاث مرات، أضف 50 ميكرولتر من PBS مع ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من DAPI وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم استخدم PBS لغسل الخلايا ثلاث مرات قبل حمايتها من الضوء. انقل اللوحة إلى المجهر الآلي.