موسوعة JoVE للتجارب
Biological Techniques
0 مشاهدة • 3:43 دقيقة • July 8th, 2025
ابدأ بالحمض النووي البلازميد المشفر للبروتين الفلوري أو تعليق pDNA في الوسائط. أضف الجسيمات النانوية المغناطيسية المتوافقة حيويا والمغلفة بالبوليمر الكاتيوني إلى تعليق pDNA واحتضانه.
تتفاعل البوليمرات الكاتيونية موجبة الشحنة إلكتروستاتيكيا وتتراترن مع الحمض النووي السائب الشحنة ، مما يؤدي إلى تكثيف الحمض النووي (pDNA) وتشكيل "تعدد الإرسال المغناطيسي" بشحنة موجبة إجمالية.
الآن ، انقل خليط polyplex إلى صفيحة متعددة الآبار تحتوي على ثقافة الخلايا العصبية الأولية الملتصقة بالفئران. قم بتركيب اللوحة متعددة الآبار فوق لوحة مغناطيسية واحتضنها.
يتسبب المجال المغناطيسي الناتج عن الصفيحة المغناطيسية في ترسيب الممرات وتراكمها على سطح الخلية العصبية. يسهل هذا الاتصال الوثيق بسطح الخلية الارتباط غير المحدد لمعدد الإرسال موجب الشحنة بالبروتيوغليكان المرتبط بغشاء الخلية سالب الشحنة.
بعد ذلك ، يتم استيعاب تعدد الإرسال عن طريق الالتقام الخلوي - وهي عملية تغزو فيها المناطق المحلية من غشاء الخلية وتضغط لتشكيل حويصلات مرتبطة بالغشاء تسمى الجسيمات الداخلية.
داخل السيتوبلازم ، تحفز البوليمرات الكاتيونية في polyplex تراكم البروتون في الجسيم الداخلي. يزيد التدفق المتزامن لأيونات الكلوريد للحفاظ على حياد الشحنة من القوة الأيونية الداخلية ، مما يؤدي إلى تدفق المياه.
في النهاية ، تنتفخ الجسيمات الداخلية وتتمزق بسبب الضغط الاسموزي ، مما يؤدي إلى إطلاق تعدد الإرسال في السيتوبلازم. يسهل الحمض النووي المكثف داخل البوليبلكس زيادة حركة العصارة الخلوية ، بينما تحمي البوليمرات الموجبة الحمض النووي (pDN) من تدهور نوكلياز السيتوبلازم.
بعد تفكك البوليبلكس ، يتم نقل الحمض النووي المحرر - خلال مرحلة دورة الخلية المناسبة عندما يتفكك الغشاء النووي مؤقتا - إلى النواة. نجحت الخلايا التي تم نقلها باستخدام pDNA عن بروتينات الفلورسنت.
لزراعة الخلايا العصبية الحركية ، قم بتخفيفها إلى 5,000 إلى 10,000 خلية في 500 ميكرولتر من وسط الثقافة لكل بئر في صفيحة 24 بئرا. بعد ذلك ، قم بإزالة المحلول الرقائقي بطرف ماصة P1000. انقل الخلايا العصبية الحركية المخففة في وسط الثقافة على الفور إلى ألواح الطلاء لتجنب الجفاف.
لتحضير الحمض النووي ، أعد تعليق 1 ميكروغرام من الحمض النووي في 50 ميكرولترا من وسط زراعة الخلايا العصبية ، والدوامة لمدة 5 ثوان. لتحضير أنبوب الخرزة ، أعد تعليق 1.5 ميكرولتر من الخرز في 50 ميكرولترا من وسط الثقافة العصبية. أضف 50 ميكرولترا من محلول الخرزة إلى 50 ميكرولترا من محلول الحمض النووي ، واحتضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
خلال هذه الحضانة ، اسحب 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع من البئر الذي سيتم نقله. بعد ذلك ، انقل 100 ميكرولتر من مزيج حبة الحمض النووي إلى كل بئر ، واحتضان الصفيحة المكونة من 24 بئرا لمدة 20 إلى 30 دقيقة على اللوح المغناطيسي عند 37 درجة مئوية.