الكشف القائم على تباين الخواص الفلورية لتفاعلات البروتين والبروتين

للكشف عن تفاعل البروتين والبروتين القائم على تباين الخواص الفلورية ، ابدأ بالبروتينات المستهدفة المؤتلفة الموسومة بزخارف رباعي الأسيستين الطرفية C في مخزن مؤقت مناسب لتباين الخواص.

أضف صبغة تحتوي على الفلوروفور - ترتبط بالبروتينات المستهدفة عبر شكل التتراسيستين. غسيل الكلى باستخدام المخزن المؤقت تباين الخواص ، وإزالة الصبغة غير المقيدة. انقل الخليط إلى كوفيت الكوارتز. قم بقياس الامتصاص ، وتحديد النسبة المئوية للبروتينات المستهدفة التي تم تصنيفها بنجاح.

في كوفيت مضان ، امزج البروتينات المستهدفة المسماة بالفلوروفور مع البروتينات غير المسماة. باستخدام مقياس الطيف فلوري ، قم بقياس تباين الفلورة.

نظرا لأن البروتينات المستهدفة تتوقف بحرية في المخزن المؤقت ، فإن الفلوروفورات المرتبطة بها تدور بشكل عشوائي حول محاورها بسبب الحركة البراونية. عند الإثارة بضوء مستقطب رأسيا بطول موجي مناسب ، تنبعث الفلوروفورات من الضوء المستقطب في المستويين الرأسي والأفقي. يتم قياس نسبة شدة التألق للانبعاثات المستقطبة الرأسية والأفقية - تباين الخواص -.

عندما ترتبط البروتينات غير المصنفة بالأهداف المسماة بالفلوروفور ، يزداد الحجم الجزيئي لمركب البروتين ، مما يقلل من حركته الدورانية. نتيجة لذلك ، يصبح الضوء المنبعث أكثر استقطابا ، مع انبعاث أعلى في المستوى الرأسي من المستوى الأفقي - مما يزيد من تباين الخواص.

أضف تركيزات متزايدة من البروتين غير المسمى وكرر قياس تباين الخواص.

تشير الزيادة غير الخطية في تباين الخواص مع زيادة إضافة البروتين غير المسمى إلى ارتباط البروتين غير المسمى في مواقع ربط متعددة غير متطابقة على البروتينات المستهدفة الموسومة بالفلوروفور.

امزج 3 نانومول من بروتين SBDS-FlAsH مع 3 نانومول من صبغة Lumio Green في حجم 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتباين الخواص. دع التفاعل يستمر لمدة 8 ساعات عند 4 درجات مئوية. بعد 8 ساعات ، قم بغسيل الكلى للعينة مقابل المخزن المؤقت لتباين الخواص طوال الليل لإزالة الصبغة الحرة. قم بقياس الامتصاص عند 280 نانومتر و 508 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي باستخدام كوفيت الكوارتز. بعد ذلك ، استخدم قانون لامبرت بير لتحديد النسبة المئوية للبروتين المسمى كما هو موضح في بروتوكول النص.

قبل قياس قيمة تباين الخواص ، يجب أن تتم كل خطوة من خطوات المعايرة بالتحليل الحجمي لرابطة البروتين بعناية ، مع التأكد من توزيع العينة بأكملها في المحلول ، وتصبح متجانسة.

في كوفيت مضان ، ضع 200 ميكرولتر من 30 نانومولار SBDS-FlAsH في مخزن مؤقت متباين الخواص ، وقم بمعايرة 2 ميكرولتر من 30 ميكرومولار EFL1. تخلط جيدا ، واترك التفاعل يقف لمدة 3 دقائق قبل قياس قيمة تباين الخواص والفلورة. كرر هذه العملية حتى يتم إضافة حجم إجمالي قدره 40 ميكرولتر من EFL1. كخطوة أخيرة ، قم بملاءمة البيانات مع نموذج ملزم مفترض ، كما هو موضح في بروتوكول النص.