الكشف عن ارتباط الفيترونكتين بالأسطح البكتيرية باستخدام قياس التدفق الخلوي

خذ أنابيب مقياس التدفق الخلوي التي تحتوي على سلالات من النوع البري والمتحولة من المستدمية النزلية من النوع f.

الماصة عبارة عن مخزن مؤقت يحتوي على بروتينات مانعة وفيترونكتين. حضن.

تقلل البروتينات المانعة من التفاعلات غير المحددة على سطح البكتيريا ، بينما ترتبط جزيئات الفيترونكتين بالبروتين H ، وهو بروتين مرتبط بفيتامين الفيترونكتين ، على الأسطح البكتيرية البرية. في السلالة الطافرة ، لا يرتبط الفيترونكتين بسبب عدم وجود بروتين H.

الطرد المركزي. إزالة الفيترونكتين غير المرتبط والبروتينات الحظرة.

أضف عازلة تحتوي على أجسام مضادة أولية مضادة للفيترونكتين ، والتي ترتبط على وجه التحديد بفيترونكتين المرتبط بالأسطح البكتيرية من النوع البري.

بعد ذلك ، أدخل الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور ، والتي ترتبط بالأجسام المضادة الأولية على الفيترونكتين وتسهل اكتشاف الفيترونكتين.

الطرد المركزي. إزالة الأجسام المضادة الثانوية غير المرتبطة. أعد تعليق البكتيريا في المخزن المؤقت.

قم بإجراء قياس التدفق الخلوي لتحديد ارتباط vitronectin بسطح البكتيريا.

قارن بين إشارات التألق للسلالات البرية والطافرة. يؤكد التحول في إشارة التألق في البكتيريا البرية ارتباط الفيترونكتين بالسطح البكتيري.

للتحضير لقياس التدفق الخلوي ، أعد تعليق الكريات البكتيرية ب 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع الذي يحتوي على 250 فيترونكتين نانومولي. ثم احتضان العينات لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة دون اهتزاز. بعد الحضانة ، قم بتقطيع البكتيريا عن طريق الطرد المركزي عند 3,500 × جم لمدة 5 دقائق. ثم اغسل الكريات ثلاث مرات باستخدام PBS وخطوات الطرد المركزي المماثلة.

بعد الغسيل ، أضف 50 ميكرولترا من الأجسام المضادة متعددة النسيلة للأغنام الأولية المضادة للإنسان إلى الحبيبات البكتيرية ، عند تخفيف 1 إلى 100 في PBS / BSA. احتضان التعليق لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل البكتيريا ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.

بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من PBS / BSA التي تحتوي على الأجسام المضادة متعددة النسيلة للحمار المترافق بالفلورسين إلى الحبيبات. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة في الظلام. أخيرا ، بعد ثلاث خطوات غسيل ، أعد تعليق الحبيبات البكتيرية ب 300 ميكرولتر من PBS ، وقم بتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي.