موسوعة JoVE للتجارب
Immunology
0 مشاهدة • 3:03 دقيقة • July 8th, 2025
خذ التخفيفات التسلسلية لجسم مضاد يستهدف فيروس الإنفلونزا هيماجلوتينين ، أو HA ، وهو بروتين سكري يتكون من رأس كروي وساق.
أضف التخفيفات إلى خلايا الثدييات المنقولة التي تعبر عن حمض الهيالورونيك المرتبط بالسطح. ترتبط الأجسام المضادة بمناطق ساق HA ، وتشكل مجمعات مناعية.
إدخال الخلايا التائية المهندسة التي تعبر عن مستقبلات Fc وترميز مراسل لوسيفيراز تحت سيطرة عامل النسخ NFAT.
أثناء الحضانة ، يرتبط الجسم المضاد المرتبط ب HA بمستقبل Fc ، بينما يرتبط رأس HA بحمض السياليك ، مما يؤدي إلى تنشيط الخلايا التائية وزيادة تركيز الكالسيوم العصاري الخلوي.
يبدأهذا التنشيط سلسلة إشارات تؤدي إلى إزالة الفسفرة من NFAT ، مما يؤدي إلى انتقالها النووي.
يرتبط NFAT بعناصر استجابته في الجينوم ، مما يؤدي إلى تعبير لوسيفيراز.
أضف ركيزة مضيئة حيوية منفذة للخلية. يؤكسد لوسيفيراز الركيزة ، مما ينتج عنه إشارة.
يؤكدانخفاض اللمعان مع انخفاض تركيز الأجسام المضادة تنشيط الخلايا التائية بوساطة الأجسام المضادة الخاصة بساق HA.
لتقييم قدرة الأجسام المضادة المحددة ذات الأهمية على استهداف الخلايا التي تعبر عن الهيماجلوتينين ، استبدل المادة الطافية لمزارع الخلايا المصابة فيروسا ب 25 ميكرولترا من السمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة ، أو ADCC ، وسط الفحص.
بعد ذلك ، في صفيحة منفصلة مكونة من 96 بئرا ، قم بإجراء تخفيفات بمقدار 4 أضعاف من الأجسام المضادة ذات الأهمية في وسط ADCC ثلاثي النسخ والطازج بدءا من 10 ميكروغرام لكل مليلتر وفقا للتخطيطي ، مع الحرص على تضمين الخلفية وعدم وجود ضوابط للأجسام المضادة.
عندما يتم تخفيف كل الجسم المضاد ، انقل 25 ميكرولترا من الجسم المضاد المخفف إلى الآبار المقابلة المناسبة في لوحة الخلية التجريبية وضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلية. بعد 15 دقيقة ، أضف 7.5 في 10 إلى خلايا Jurkat المستجيب المعدلة الرابعة ، معبرا عن مستقبل Fc المناسب لكل بئر في 25 ميكرولتر من وسط ADCC للحصول على حجم نهائي يبلغ 75 ميكرولتر من وسط ADCC لكل بئر.
أعد اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة 6 ساعات ، مع إذابة المخزن المؤقت لركيزة لوسيفيراز في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية خلال الساعة الأخيرة من الحضانة. عندما يكون المخزن المؤقت جاهزا ، أضف 75 ميكرولترا من المخزن المؤقت لركيزة لوسيفيراز إلى جميع الآبار باستثناء بئر التحكم في الخلفية ، واقرأ اللوحة على مقياس الإضواء. يمكن بعد ذلك حساب تحريض الطية للسمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة في مزارع الخلايا المنقولة أو المصابة.