موسوعة JoVE للتجارب
Neuroscience
0 مشاهدة • 2:41 دقيقة • July 8th, 2025
ابدأ بزراعة الخلايا الجذعية الجنينية للفأر.
اغسل الخلايا بمخزن مؤقت لإزالة الوسائط وحطام الخلايا.
أضف كوكتيل إنزيم لفصل الخلايا عن سطح القارورة.
أضف وسائط لإيقاف النشاط الأنزيمي وجمع الخلايا في أنبوب. جهاز الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية المحتوية على الإنزيمات.
أعد تعليق الخلايا في وسط زراعة الخلايا العصبية الخالية من المصل.
بذر الخلايا في آبار ألواح متعددة الآبار المطلية بالجيلاتين.
حضن. تلتصق الخلايا الجذعية الجنينية بالسطح المغطى بالجيلاتين. تسهل مكونات الوسائط ، بما في ذلك العناصر الغذائية وعوامل النمو والهرمونات ، تكاثر الخلايا وتشكل طبقة أحادية.
عند كثافة الخلايا هذه ، تنتج الخلايا الجذعية الجنينية وتطلق المستويات المثلى من عوامل النمو والسيتوكينات.
تؤديهذه الجزيئات إلى مسارات إشارات داخل الخلايا ، مما يسهل تمايز الخلايا الجذعية الجنينية إلى أسلاف عصبية.
امزج الجيلاتين مع 500 مل من PBS الدافئ وقم بتغطية قاع حاوية زراعة الخلايا بما يكفي من المحلول لتغطية السطح. أثناء طلاء الجيلاتين ، اشطف المزرعة الفرعية للخلايا الجذعية الجنينية للفأر مرتين في PBS. ثم أضف 1 ملليلتر من كاشف التفكك إلى الثقافة.
بعد دقيقتين إلى خمس دقائق ، اضغط على الوعاء لإخراج الطبقة الأحادية إلى معلق أحادي الخلية وجمع الثقافة في ما مجموعه 10 ملليلتر من كاشف تفكك الخلية والمتوسطة.
انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر وقم بتدويرها في جهاز طرد مركزي. بعد ذلك ، بعد الشفط الدقيق للطافي ، قم بتعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من ماصة N2B27 الدافئة مسبقا على جانب الأنبوب لتجنب تكوين فقاعات.
الآن ، قم بحساب الخلايا التي تسجل التركيز وأعد تعليقها عند العدد المناسب من الخلايا لكل وحدة حجم لكل بئر في N2B27 الدافئ مسبقا وفقا للجدول. بعد ذلك ، قم بشفط الجيلاتين من وعاء الاستزراع وقم بوضع الخلايا دون تحريك الحاوية.
ضع المزرعات في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، واستبدل الوسط كل يوم إلى يومين ب N2B27 الطازج.