موسوعة JoVE للتجارب
Neuroscience
0 مشاهدة • 3:32 دقيقة • July 8th, 2025
ابدأ بأحادي الفوسفات الأدينوسين الدوري ، أو cAMP ، وهو جزيء إشارات ينظم الوظائف الخلوية المختلفة. إضافة cAMP إلى ثقافة مشتركة للخلايا العصبية والبلاعم.
تؤدي جزيئات المخيم من الوسط وعوامل النمو من الخلايا العصبية إلى تنشيط البلاعم.
انقل الملحق مع البلاعم المنشطة إلى بئر آخر يحتوي على وسط ثقافة البلاعم.
هنا ، تطلق البلاعم السيتوكينات والكيموكينات في الوسط ، وتشكل وسطا مشروطا أو CM.
الطرد المركزي CM لتكوير المكونات الخلوية.
انقل المادة الطافية والفلتر لإزالة الحطام الخلوي.
أضف CM الذي تم جمعه إلى ثقافة الخلايا العصبية. تعمل السيتوكينات والكيموكينات في CM المجمعة على تعزيز امتدادات الخلايا العصبية.
أضف بارافورمالدهيد المبرد لإصلاح الخلايا.
أضف حاجزا حاجب لتجنب الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة. اغسل لإزالة المخزن المؤقت المتبقي.
تطبيق الأجسام المضادة الأولية التي تستهدف بروتينات الهيكل الخلوي للخلايا العصبية. يغسل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.
أضف الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور الأحمر التي ترتبط بالأجسام المضادة الأولية. يغسل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.
باستخدام الفحص المجهري الفلوري ، تصور الخلايا العصبية ذات اللون الأحمر مع الامتدادات.
بعد أربع ساعات من الزراعة المشتركة للبلاعم العصبية ، أضف 2 ميكرولتر من محلول 100 ميكرومولار ديسيبل-cAMP إلى الثقافات المشتركة للبلاعم العصبية. بعد 24 ساعة ، املأ بئرا فارغة ب 1 مليلتر من وسط زراعة البلاعم في نفس الطبق المكون من 6 آبار.
انقل إدراج ثقافة الخلية في الزراعة المشتركة للبلاعم العصبية إلى البئر الفارغ باستخدام وسط زراعة البلاعم. بعد 72 ساعة ، قم بالطرد المركزي للوسط المكيف بالبلاعم عند 239 جم لمدة خمس دقائق لإزالة المكونات الخلوية. مرر المادة الطافية عبر مرشح 0.2 ميكرومتر لإزالة أي حطام خلوي متبقي.
في هذا الإجراء ، قم بتغطية شريحة غرفة مكونة من 8 آبار باستخدام بولي D-lysine واللامينين. بعد ذلك ، احصل على الخلايا العصبية DRG البالغة المرتبطة في الوسط العصبي القاعدي ، مكملة ب B 27. لوحة 5 × 104 خلايا لكل بئر على شريحة غرفة 8 آبار مطلية مسبقا.
بعد ذلك ، ضع شريحة الغرفة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين ، مما يسمح للخلايا بالالتصاق بالأسفل. بعد ذلك ، استبدل وسط الاستزراع بوسط مكيف مذاب يتم تسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية. بعد 15 ساعة من الطلاء الأولي ، قم بإزالة الوسط وغسل الخلايا باستخدام PBS مرة واحدة.
بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من محلول بارافورمالدهيد المثلج بنسبة 4٪ إلى الآبار واحتضان الخلايا بمحلول بارافورمالدهيد لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، احتضان الخلايا الثابتة بمحلول الأجسام المضادة الأولية ، المخفف بمصل الماعز العادي بنسبة 10٪ لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، التقط صورا باستخدام المجهر الفلوري لتصور نمو العصب.