توليد الغلاف الفلكي وصيانته باستخدام الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

ابدأ بلوحة مغلفة ب ECM ومجموعات بذور من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في وسط نمو يحتوي على مثبطات Rho-kinase.

يعزز

ECM ارتباط الخلايا ، بينما تمنع المثبطات Rho-kinases ، مما يمنع موت الخلايا المبرمج ويعزز بقاء الخلايا وتكاثرها.

إدخال وسيط تمايز عصبي للحث على تمايز الخلايا الجذعية إلى خلايا سلفية عصبية.

عالج بمحلول انفصال ؛ تعمل الإنزيمات الموجودة في هذا المحلول على تحلل ECM وتلامس الخلايا ، وتطلق الخلايا.

انقلها إلى قارورة غير مغلفة تحتوي على مثبطات رو-كيناز.

تسهل المثبطات بقاء الخلية والتجميع التلقائي في هياكل ثلاثية الأبعاد أو كرويات.

استكمل الكرويات بوسيط تمايز عصبي غني بعامل النمو ، مما يسمح للخلايا السلفية العصبية بالتمايز إلى أسلاف الخلايا النجمية وتشكيل الغلاف الفلكي.

بانتظام ، أضف محلول انفصال لفصل الغلاف الفلكي إلى مجموعات أصغر. هذا يسمح للمغذيات بالوصول إلى الخلايا الداخلية للكروية والحفاظ على صلاحيتها.

حافظ على الغلاف الفلكي في وسط جديد حتى تنضج الأسلاف إلى الخلايا النجمية.

ابدأ ببذر مجموعات من hPSCs في 2 مل من وسط hPSC الذي يحتوي على مثبط Rho-kinase Y-27632 في كل بئر من صفيحة من ستة آبار مطلية ب ECM. حافظ على الخلايا الجذعية حتى تصبح حوالي 50٪ ملتقية. بعد ذلك ، قم بتغيير الوسط إلى الوسط العصبي الذي يحتوي على SP-431542 و DMH1 لتعزيز الحث العصبي.

عندما تكون الخلايا حوالي 95٪ ملتقية ، قم بتقسيم كل بئر من 1 إلى 6 إلى آبار جديدة مطلية ب ECM. في اليوم 14 ، قم بفصل الخلايا بمحلول الانفصال ، وانقل محتويات كل بئر إلى قارورة T-25 غير مطلية بوسط يحتوي على Y-27632 لتعزيز تكوين الركام.

لتوليد أسلاف الخلايا النجمية والخلايا النجمية في مجاميع ثلاثية الأبعاد متكونة تلقائيا ، قم بالتبديل إلى الوسط العصبي الذي يحتوي على EGF و FGF2 وتغذي كل ثلاثة إلى أربعة أيام حتى يتم تأكيد هوية الخلايا النجمية في أربعة إلى ستة أشهر.

بشكل افتراضي ، ينتج هذا البروتوكول الخلايا النجمية القشرية الظهرية. ومع ذلك ، يمكن تحديد الأنواع الفرعية للخلايا النجمية إقليميا عن طريق إضافة مورفوجينات الزخرفة إذا رغبت في ذلك.

مرة واحدة في الأسبوع ، عندما تظهر المراكز المظلمة ، اجمع الكرات عن طريق الطرد المركزي ، ثم قم بفصل مجاميع H-astro برفق بمحلول الانفصال. قم فقط بإعادة طلاء تلك المجالات التي لا ترتبط تلقائيا لتجنب مرور الخلايا غير العصبية وغير العصبية.