موسوعة JoVE للتجارب
Neuroscience
0 مشاهدة • 3:09 دقيقة • July 8th, 2025
خذ تعليق الخلايا الجذعية الجنينية للفأر.
أجهزة الطرد المركزي ، وإزالة المادة الطافية ، وإعادة تعليق الخلايا في وسط التمايز العصبي.
ضع قطرات من التعليق على الجانب الداخلي من غطاء لوحة الزيادة.
أضف حاجزا إلى اللوحة السفلية لمنع القطرات من الجفاف. ضع الغطاء على اللوحة السفلية ، وشكل ثقافة قطرة معلقة ، واحتضنها.
بسبب الجاذبية ، تتجمع الخلايا وتشكل مجاميع ثلاثية الأبعاد تسمى الأجسام الجنينية أو EBs.
ضع القطرات في صفيحة تحتوي على وسط التمايز واحتضانها تحت التحريض لنمو EBs.
جهاز الطرد المركزي وإزالة الوسيط ؛ قم بتعليق EBs في وسط التمايز المكمل بحمض الريتينويك ، ونقلها إلى لوحة الثقافة ، واحتضنها.
يدخل حمض الريتينويك إلى الخلايا ويؤدي إلى تكوين مركب نسخ. يحفز المركب التعبير الجيني ، مما يؤدي إلى التمايز إلى خلايا سلفية عصبية.
EBs المتباينة جاهزة للتطبيقات النهائية.
ابدأ بإعداد ثقافة الخلايا المتساقطة المعلقة. بالنسبة للوحة زراعة الخلايا التي يبلغ طولها 10 سم ، اضبط التركيز على 500 خلية لكل 20 ميكرولتر من وسط التمايز. قم بإعداد تعليق خلوي كاف ل 50 قطرة سعة 20 ميكرولتر. استخدم ماصة دقيقة أو ماصة مكررة لوضع قطرات سعة 20 ميكرولترا من معلق الخلية على غطاء لوحة زراعة الأنسجة، مع التأكد من أن القطرات ليست قريبة جدا من بعضها البعض لمنعها من الاندماج.
املأ الطبق ب 5 إلى 10 ملليلتر من PBS ، ثم أعد الغطاء بعناية إلى اللوحة. احتضان الثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية. بعد يومين ، اجمع القطرات من الغطاء ، وضعها في لوحة تعليق لثقافة الخلايا بطول 10 سم ، مملوءة ب 10 مل من وسط التمايز. بعد ذلك ، ضع اللوحة على شاكر مداري مضبوطة على سرعة منخفضة في الحاضنة. بعد يومين آخرين ، قم بالطرد المركزي للخلايا بمعدل 200 مرة جم لمدة ثلاث دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية.
للحث على تمايز الجسم الجنيني إلى خلايا سلفية عصبية ، أعد تعليق الخلايا في وسط التمايز بحمض الريتينويك 5 ميكرومولار. احتضن الطبق لمدة يومين. بعد ذلك ، استبدل النصف الأدنى من الوسط بوسط جديد عن طريق إمالة اللوحة وإخراجها للخارج.