توليد الخلايا العصبية والخلايا الدبقية من الأجسام الجنينية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة عن طريق الإنسان

خذ الأجسام الجنينية ، أو EBs ، المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان. تتكون هذه الدرجات الكهربية من ثلاث طبقات جرثومي.

انقل EBs إلى طبق ثقافة مغطى بالمصفوفة يحتوي على وسط مناسب واحتضانه.

تمكن

المصفوفة EBs من التعلق بطبق الثقافة.

تسهل عوامل النمو والعناصر الغذائية في الوسط خلايا الأديم الظاهر في EBs لتشكيل مجاميع ظهارية عصبية مرتبة في نمط دائري يسمى الوردة.

قطع شظايا الوردة وفصلها عن الطبق.

اجمع الأجزاء وقم بتدويرها.

تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الشظايا.

باستخدام ماصة ، حرك الشظايا لأعلى ولأسفل لفصلها.

أضف العدد المطلوب من الخلايا إلى صفيحة بئر مطلية بالمصفوفة تحتوي على وسط تمايز.

تسهل مكونات وسط التمايز الخلايا الظهارية العصبية للتحول إلى خلايا عصبية ودبقية تعمل بكامل طاقتها ، وهي الخلايا الأولية للجهاز العصبي.

في اليوم الثاني ، قم بشفط محلول طلاء المصفوفة القياسي من طبق 60 مليلتر معد مسبقا ، وأضف 5 ملليلتر من وسط الحث الظهاري العصبي الكامل أو NRI إلى الطبق. العمل تحت المجهر المجسم بتكبير 4 أضعاف ، وباستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ، اجمع حوالي 50 جسما جنينيا عائما ونقله إلى طبق مطلي واحد. ثم احتضن الطبق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

في اليوم التالي ، اليوم الثالث من إجراء التمايز ، افحص الطبق تحت المجهر بتكبير 10 أضعاف للتأكد من أن جميع الأجسام الجنينية متصلة. بعد ذلك ، قم بإجراء تغيير متوسط كلي برفق باستخدام وسيط NRI كامل. قم بتغيير وسط NRI كل يومين حتى اليوم السابع عندما تكون المجاميع الظهارية العصبية الشبيهة بالوردة مرئية.

في اليوم السابع ، قم بتغطية صفيحة مكونة من 96 بئرا عن طريق سحب 100 ميكرولتر من المصفوفة القياسية المخففة في وسط الاستزراع في كل بئر. في اليوم الثامن ، قم بتقطيع الركام الشبيهة بالوردة إلى أجزاء تحت مجهر مجسمة بتكبير 10 أضعاف في ظروف معقمة.

لاحظ أن الوريدات تميل إلى الانفصال بسهولة عن الطبق عند لمسها بالإبرة. في هذه الحالة ، قم بفصل الوردة المنفصلة جزئيا بطرف الإبرة. إذا ظلت الوريدات متصلة جزئيا، فاستخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر لإكمال فصل شظايا الوردة.

تتطلب قصاصات الوردة مهارات يدوية جيدة ودقة لتجنب قطع المشتقات غير الظاهرية العصبية.

بعد ذلك ، اجمع شظايا الوردة ووسطها في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. شطف الطبق مع 2 ملليلتر من وسط NRI لاستعادة جميع الشظايا. ثم قم بتدوير شظايا الوردة بمعدل 112 مرة جم لمدة دقيقة أو دقيقتين.

بعد شفط المادة الطافية ، قم بتعليق الحبيبات برفق في 1 مليلتر من 1x DPBS الدافئ مسبقا بدون الكالسيوم والمغنيسيوم. قم بتقطيع شظايا الوردة برفق لأعلى ولأسفل لفصلها جزئيا. ثم أضف 4 ملليلتر من وسط NRI الكامل واحسب الخلايا باستخدام تريبان الأزرق وعداد الخلايا الآلي.

بعد ذلك ، قم بشفط محلول طلاء المصفوفة القياسي من الصفيحة المكونة من 96 بئرا ، وقم بإيداع الخلايا في الآبار بكثافة حوالي 15,000 خلية لكل سنتيمتر مربع في وسط NRI. احتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم 10 ، قم بإجراء تغيير متوسط كلي باستخدام وسيط التمايز العصبي الكامل.