عزل واستزراع الخلايا السليفة قليلة التغصن من قشرة دماغ جرو الفأر

خذ قشرة جرو الفأر.

أضف إنزيما محللا للبروتين يهضم المصفوفة خارج الخلية للنسجة. ثم ، قم بفصل الأنسجة ميكانيكيا ، وقم بفك الخلايا.

أضف الوسائط الدبقية و DNase لتحلل أي حمض نووي ملوث.

فصل الأنسجة ميكانيكيا لإطلاق الخلايا العصبية والخلايا الدبقية.

بمجرد أن يستقر النسيج غير المهضوم ، اجمع الوسائط التي تحتوي على الخلايا وأجهزة الطرد المركزي. قم بإزالة المادة الطافية.

أعد تعليق الخلايا في الوسائط الدبقية ووضعها على قارورة مصفوفة مغلفة بالبروتين خارج الخلية.

حضن. تلتصق الخلايا النجمية بالسطح المطلي بقوة أكبر من الخلايا الأخرى. تعزز الوسائط الدبقية بقاء الخلايا الدبقية فقط.

استبدل الوسائط لإزالة الحطام.

احتضان مع الاهتزاز لفصل الخلايا السليفة قليلة التغصن المغطاة ، OPCs ، والخلايا الدبقية الصغيرة.

انقل الوسائط مع الخلايا إلى لوحة ثقافة.

احتضان مع الاهتزاز لتسهيل التصاق الخلايا الدبقية الصغيرة التفاضلية.

انقل المادة الطافية OPC غير الملتصقة إلى صفيحة متعددة الآبار مطلية ب poly-D-lysine. احتضان للالتزام OPC.

استبدل الوسائط بوسائط OPC ، مما يسمح بنمو OPC.

أضف 1 مليلتر من 0.05٪ تريبسين مع 0.53 مللي مولار EDTA إلى كل أنبوب به أنسجة. قم بثلاثية الخليط بماصة سعة 10 ملليلتر حوالي 20 مرة. ثم انقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي فارغ سعة 50 ملليلترا.

احتضن المحلول عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 15 دقيقة ، مع تحريك المحللات برفق بعد ثماني دقائق. بعد الحضانة ، أضف 5 ملليلتر من MGM ، و 200 ميكرولتر من DNase-I إلى كل أنبوب للحصول على تركيز نهائي يبلغ 50 ميكروغرام لكل مليلتر. قم بترقيم كل محللة 10 مرات باستخدام ماصة سعة 10 ملليلتر.

بعد ذلك ، اترك معلق الخلية لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح للأنسجة غير المنفصلة بالاستقرار في قاع الأنبوب. انقل معلقات الخلية إلى أنابيب مخروطية جديدة سعة 50 مليلتر ، تاركة وراءها الأنسجة غير المنفصلة. بعد الطرد المركزي ، قم بتعليق حبيبات الخلية في 5 ملليلتر من MGM وقم بترتيبتها 20 مرات.

ضع معلقات الخلية على قوارير T-25 المطلية ، واحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لإجراء عزل الخلايا السليفة قليلة التغصن ، رج الخلايا لمدة 15 ساعة. ثم قم بإزالة المادة الطافية من القارورة ووضعها على طبق بتري معقم.

احتضان المادة الطافية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة ، مع الدوران بعد 15 دقيقة لإزالة الخلايا الدبقية الصغيرة المتبقية. إزالة الخلايا الطافية غير الملتصقة. عد الخلايا وقم بوضعها على سطح مطلي ب poly-D-lysine بالتركيز المطلوب.

أعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد ذلك ، قم بشفط 95٪ من الوسائط برفق وأضف وسائط OPC الدافئة ببطء ، وقم بسحب ماصاتها على جدار البئر لتقليل اضطراب OPCs.