تقنية لتوليد عضيات الدماغ من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

خذ مستعمرات من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، أو hESCs ، المزروعة على مصفوفة داعمة.

استنشق الوسط وأضف الإنزيمات التي تحلل المصفوفة.

يغسل لإزالة الإنزيمات. ثم أضف وسيطا وماصة لإخراج المستعمرات المخففة ، وتقسيمها إلى مجموعات أصغر.

انقل العناقيد إلى وسط جديد واحتضانه ، مما يسمح للعناقيد بتكوين مجاميع كروية.

اسمح للكرات بالاستقرار وإزالة أي خلايا ميتة.

احتضان بوسيط يحتوي على عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي ، أو bFGF ، لتكاثر الخلايا.

قم بالتجديد بوسائط تحتوي على تركيزات bFGF متناقصة تدريجيا لتسهيل تمايز الخلايا.

أدخل وسيطا تحريضيا عصبيا ، مما يعزز تمايز hESC إلى خلايا جذعية عصبية أو NSCs ، وتحويل الكرات إلى عضيات تظهر بنية شبيهة بالوردة العصبية.

أضف المضادات الحيوية لمنع نمو أي ميكروبات ملوثة أثناء الاستزراع المطول.

تتمايز الخلايا العصبية الوطنية إلى خلايا عصبية وخلايا دبقية ، وتطور العضيات تدريجيا إلى بنية معقدة تشبه قشرة الدماغ.

قم

بتخفيف محلول مخزون البروتياز إلى تركيز العمل عن طريق إضافة 1 مليلتر من محلول المرق إلى 5 ملليلتر من وسط DMEM أو F12 لكل صفيحة ذات 6 آبار من hESCs. قم بشفط وإزالة وسائط زراعة الخلايا ثم قم بتغطية hESCs بمحلول البروتياز ضع الألواح في الحاضنة لمدة 10 إلى 15 دقيقة ، أو حتى تتجمع حواف المستعمرات وتبدأ في الانفصال عن المصفوفة ، ولكن قبل أن تتجمع تماما.

قم بإمالة اللوحة ، واستنشق محلول البروتياز ، واغسل الخلايا برفق ب 2 مل من DMEM أو F12 لكل بئر ثلاث مرات. تأكد من بقاء المستعمرات متصلة بالمصفوفة.

لذلك من الأهمية بمكان أن تكون قطع SL هي الحجم المناسب. لذا تأكد من أنهم في حالة اختلافية لفترة زمنية مناسبة. إذا كانوا هناك لفترة قصيرة جدا ، فقد يكون من الصعب جدا طردهم وتفكيكهم. وإذا بقوا هناك لفترة طويلة جدا ، فيمكنهم في الواقع الخروج أثناء خطوات الغسيل.

أضف حوالي 1 إلى 1.5 مل من وسائط mTESR الطازجة إلى كل بئر ، وقم بغسل خلايا اللوحة في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر باستخدام ماصة لطيفة ، وشفط واستغناء عن hESCs داخل اللوحة حتى تصل إلى حوالي 1/30 من حجمها الأصلي. الآن ، تشبه مجموعات المستعمرة قطعة بحجم 250 إلى 350 ميكرومتر.

انقل الخلايا إلى قارورة T75 واحدة منخفضة للغاية ، تحتوي على ملليلتر من وسائط mTESR بدون bFGF. في اليوم التالي ، قم بإمالة القارورة ، بحيث تتجمع الخلايا الحية في الزاوية. إذا كان هناك عدد كبير من الخلايا التي التصقت بأسفل القارورة، فاستخدم ماصة سعة 10 ملليلتر لنقل الخلايا إلى قارورة جديدة.

توقع أن يكون لديك عدد كبير من الخلايا الميتة في الأيام القليلة الأولى. بمجرد أن تستقر الخلايا ، استنشق الوسائط والخلايا الميتة ، تاركا حوالي 10 ملليلتر من الوسائط التي تحتوي على الخلايا الحية ، وأضف 20 مل من وسائط bFGF المنخفضة ، مع استكمال 30 نانوغرام لكل مليلتر من bFGF. بعد يومين ، افحص الخلايا. يجب أن تبدو معظم الخلايا صحية ومشرقة.

ومع ذلك ، إذا بدا أكثر من ثلث الخلايا مظلما ، فقم بإمالة القارورة ، واستبدل 20 مل من الوسائط ب 20 مل من وسائط bFGF منخفضة مكملة ب 20 نانوغرام لكل مليلتر من bFGF. في اليوم 3 ، قم بإزالة نصف الوسائط ، واستبدلها ب 15 مل من وسائط HSC ، مع استكمال 10 نانوغرام لكل مليلتر من bFGF.

في اليوم 5 ، استبدل نصف الوسائط ب 50 مل من وسائط الحث العصبي. بعد ذلك ، كل يومين ، استبدل نصف الوسيط بوسائط الحث العصبي. بعد ثلاثة أسابيع في المزرعة ، أضف 100x البنسلين والستربتومايسين إلى الوسائط بتركيز نهائي قدره 1x إذا رغبت في ذلك. قم بتحديث نصف الوسائط كل يومين.