تنقية الشعيرات الدموية من دماغ الخنازير

خذ دماغ الخنزير.

قم بإزالة السحايا ، الغشاء الواقي الذي يغطي الدماغ ، لمنع تلوث الخلايا السحائية.

اكشط المادة الرمادية ، وهي منطقة غنية بالشعيرات الدموية ، واجمع الأنسجة في طبق استزراع يحتوي على وسائط.

مرر المادة الرمادية من خلال حقنة بدون إبرة لتفتيت الأنسجة.

انقل الشظايا إلى الخالط وتجانسها لتفكيك الأنسجة بشكل أكبر ، وتحرير الشعيرات الدموية في الدماغ.

قم بتمرير الجانس عبر مرشح بحجم مسام محدد للاحتفاظ بالشعيرات الدموية ، مما يسمح لخلايا الدماغ الأخرى بالتدفق من خلالها.

ضع المرشح في محلول يحتوي على الإنزيمات و DNase.

تقوم

الإنزيمات بفصل الخلايا الملتصقة ، بينما يتحلل DNase للحمض النووي الملوث ، مما يسهل عزل الشعيرات الدموية النقية.

اغسل الشعيرات الدموية من الفلتر.

أضف وسائط تحتوي على بروتينات المصل لتعطيل الإنزيمات.

انقل الشعيرات الدموية إلى أنبوب ، وجهاز طرد مركزي ، وقم بإزالة المادة الطافية. قم بتعليق الشعيرات الدموية النقية في وسائط جديدة لمزيد من التحليل.

لبدء هذا الإجراء ، ضع الأدمغة في مقعد تدفق معقم ، واغسلها برفق باستخدام 1 لتر من PBS في دورق يوضع على الجليد. بعد ذلك ، قم بإزالة السحايا بعناية من كل دماغ باستخدام ملقط رفيع الأطراف. باستخدام مشرط ، اكشط المادة الرمادية من الأدمغة واحدة تلو الأخرى ، وانقل المادة المعزولة إلى أطباق بتري التي تحتوي على 20 مل من DMEM / F12 الموضوعة على الجليد.

للتجزئة الأولية ، قم بتشغيل مادة المادة الرمادية من خلال حقنة سعة 50 مليلتر بدون إبرة. كرر الإجراء لجميع الأدمغة وقم بتجميع مادة المادة الرمادية المجمعة معا. انقل مادة المادة الرمادية المعزولة باستخدام وسيط DMEM / F12 إلى أنبوب المطحنة لمحلل الأنسجة المحمول. قم بتجانس المادة عن طريق عمل 8 ضربات لأعلى ولأسفل باستخدام مدقة فضفاضة ، متبوعة ب 8 ضربات لأعلى ولأسفل بمدقة ضيقة.

بعد ذلك ، قم بعزل الشعيرات الدموية عن طريق تصفية التجانس باستخدام زجاجة غطاء أزرق سعة 500 مل مع حامل مرشح وشبكة مرشح 140 ميكرون. ضع الشعيرات الدموية التي تحتوي على مرشحات في أطباق بتري مع محلول الهضم. بعد ذلك ، احتضن أطباق بتري عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على شاكر مداري بسرعة 180 دورة في الدقيقة ، أو حركها برفق كل 10 دقائق.

بعد ساعة واحدة ، اغسل الشعيرات الدموية من المرشحات مع تعليق من طبق بتري. بعد ذلك ، قم بتقسيم التعليق من الأطباق الثلاثة إلى أنبوبين سعة 50 مليلتر ، وأوقف عملية الهضم بإضافة 10 مل من DMEM / F12 إلى كل أنبوب سعة 50 ملليلترا.

جهاز الطرد المركزي معلق الخلية عند 250 مرة جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، قم بشفط المواد الطافية ، وأعد تعليق كل حبة في 10 ملليلتر من DMEM / F12. ثم أضف 20 مل أخرى من DMEM / F12 إلى كل أنبوب.