موسوعة JoVE للتجارب
Neuroscience
0 مشاهدة • 3:29 دقيقة • July 8th, 2025
تبدأ مع iPSCs البشرية هندسيا التي تحتوي على تمايز myoblast أو MYOD بروتين ترميز, الجين المحفز للدوكسيسيكلين في وسط الخلايا الجذعية التي تحتوي على مثبطات رو-كيناز.
انقل الخلايا إلى ألواح مغلفة ب ECM واحتضانها لتعزيز ارتباط الخلية.
وفي الوقت نفسه ، يقوم المثبط بتعطيل إنزيمات Rho-kinase داخل الخلايا ، مما يعزز صلاحية الخلية.
استبدل الوسط بوسط خلية جذعية يحتوي على الدوكسيسيكلين.
يدخل الدوكسيسيكلين إلى الخلايا ويرتبط بالبروتينات المنشطة. ترتبط هذه المجمعات بالمحفز ، مما يؤدي إلى التعبير الجيني في بعض الخلايا وإنتاج بروتينات MYOD ، والتي تؤدي إلى تمايز الخلايا الجذعية إلى خلايا عضلية.
عالج الخلايا بوسط تمايز عضلي يحتوي على عوامل تمايز عضلي لتعزيز تكوين الأنابيب العضلية ، وهي خلية عضلية متعددة النوى.
في وقت لاحق ، أدخل وسيطا تحريضيا عصبيا مع عوامل النمو العصبي.
هذه العوامل تميز iPSCs المتبقية إلى الخلايا العصبية الحركية وخلايا شوان التي تشكل غمد المايلين حول الخلايا العصبية.
أخيرا ، استبدل الوسط بوسيط تقاطع عصبي عضلي لتعزيز الروابط بين الخلايا العصبية الحركية والأنبوب العضلي ، وتشكيل تقاطعات عصبية عضلية.
اغسل الخلايا ب 3 ملليلتر من PBS قبل إضافة 1 ملليلتر من محلول انفصال الخلايا إلى طبق بتري. بعد 10 دقائق عند 37 درجة مئوية ، أضف 3 ملليلتر من وسط الخلايا الجذعية الجنينية للرئيسيات إلى كل بئر ، وقم بالماصة برفق ثلاث مرات لفصل الخلايا عن الغطاء.
بعد ذلك ، قم بتجميع الخلايا الجذعية المنفصلة التي تحتوي على مواد طافية في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر للطرد المركزي ، وأعد تعليق حبيبات الخلايا الجذعية في 3 ملليلتر من وسط الخلايا الجذعية الجنينية الطازجة للرئيسيات المكمل بمثبط 10 ميكرومولار Y27632 ROCK للعد.
بعد ذلك ، قم بتخفيف الخلايا إلى 2 × 105 خلايا لكل مليلتر من الوسط ، مع استكمال تركيز مثبط ROCK ، وأعد 2 ملليلتر من الخلايا إلى كل غطاء في كل بئر من الصفيحة المكونة من 6 آبار المطلية بالمصفوفة خارج الخلية.
بعد 24 ساعة ، استبدل المادة الطافية في كل بئر ب 2 ملليلتر من وسط الخلايا الجذعية الجنينية الطازجة للرئيسيات المكملة ب 1 ميكروغرام لكل مليلتر من الدوكسيسيكلين ، وأعد الصفيحة إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة.
في نهاية الحضانة ، استبدل المواد الطافية ب 2 مل من وسط التمايز المكمل بالدوكسيسيكلين لكل بئر ، وأعد اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة 10 أيام.
في نهاية الحضانة ، استبدل المواد الطافية ب 2 مل من وسط التمايز العضلي المكمل بالدوكسيسيكلين لكل بئر ، وأعد اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة 10 أيام إضافية. في نهاية الحضانة ، استبدل المواد الطافية ب 2 ملليلتر من وسط الوصلة العصبية العضلية لكل بئر ، وأعد اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة 30 يوما.