تمايز الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى خلايا سلفية عصبية

خذ صفيحة دقيقة تحتوي على مزرعة ملتصقة من الخلايا الليفية الجنينية للفأر ، أو MEFs ، في وسط.

تعمل MEFs الملتصقة كطبقة مغذية ، مما يوفر بيئة مكروية داعمة لزراعة الخلايا.

قم بإزالة الوسط وأدخل الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية ، أو hiPSCs ، في وسط hiPSC مكمل بجزيئات صغيرة تعزز بقاء الخلية.

احتضان للسماح لمركبات الاحتجاز العالي للخلايا بالالتصاق بطبقة التغذية ، والتي تفرز عوامل النمو التي تسهل انتشار hiPSC.

قم بإزالة الوسط وأضف محلول إنزيم لفصل الخلايا. انقل الخلايا وقم بطردها المركزي ، ثم قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليقها في وسط hiPSC.

انقل الخلايا إلى صفيحة مطلية بالبوليمر الحيوي. احتضان للسماح ل MEFs بالالتماسك.

انقل hiPSCs المعلقة إلى صفيحة دقيقة على شكل حرف V. الطرد المركزي للخلايا واحتضانها ، مما يؤدي إلى تكوين تراكم الخلية.

التجديد بوسيط التمايز. تسهل العناصر الغذائية للوسط وتفاعلات الخلية والخلية داخل الركام تمايز hiPSC إلى خلايا سلفة عصبية.

بالنسبة لهذا البروتوكول ، ابدأ بإنشاء خلايا مغذية. لإنشاء هذه الثقافة ، قم بوضع 600,000 خلية مغذية في كل بئر من صفيحة مكونة من ستة آبار ، مع 300 مل من الوسط لكل بئر. بعد زراعة الخلايا المغذية لمدة 48 ساعة ، استبدل الوسط ، واحتضن الألواح لمدة ساعة ، أثناء تحضير الخلايا الجذعية.

قم بإذابة الخلايا الجذعية في حمام مائي 37 درجة مئوية. بمجرد إذابتها ، انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي الشكل سعة 15 مليلتر واملأ الأنبوب إلى 5 مل بوسط استزراع ، مضافا بالتنقيط. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا برفق لمدة أربع دقائق. استنشق المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات برفق في 1 مليلتر من وسط الخلايا الجذعية باستخدام مثبط ROCK.

بعد تحديد كثافة الخلية ، ضع 300,000 خلية جذعية على الخلايا المغذية. بعد ذلك ، قم بتنمية الثقافات وتوسيعها ، واختيار الخلايا السليمة بشكل دوري. بعد التوسع والتجميد للخلايا للنسخ الاحتياطي ، قم بزراعة مستعمرات الخلايا الجذعية على ألواح قياسية حتى تصل إلى التقاء 50٪ إلى 70٪.

بعد ذلك، استخدم علاجا إنزيميا خفيفا ومعايرة لطيفة بطرف ماصة سعة 1 مليلتر لحصاد الخلايا المنخفضة العليا للسلائف العصبية. الطرد المركزي بلطف تعليق, شفط طاف, وإعادة تعليق الحبيبات في 5 ملليلتر iPSC الإنسان متوسط. بعد ذلك ، انقل معلق الخلية إلى طبق ثقافة خلية مطلي بالجيلاتين بنسبة 5 سم بنسبة 0.1٪ ، واحتضان اللوحة لمدة ساعة واحدة.

بعد ساعة ، انقل الخلايا غير الملتصقة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلترا. ثم اشطف اللوحة برفق مع 3 ملليلتر من الوسط ، وانقلها إلى نفس الأنبوب. بعد ذلك ، كرر خطوة إعادة التعليق باستخدام الطرد المركزي اللطيف.

بعد ذلك ، حدد كثافة الخلية وقم بتقطيع الخلايا إلى صفيحة قاع على شكل حرف V ذات 96 بئرا ومنخفضة الالتصاق عند 9,000 خلية لكل بئر. الآن ، قم بتدوير اللوحة لمدة ثلاث دقائق وابدأ في زراعة الخلايا. على مدار ال 14 يوما القادمة ، كل يومين ، استبدل نصف الوسط بمتوسط مفاضل طازج.