تركيب النوافذ البصرية في دماغ الفئران المعدلة وراثيا لتصوير الأنشطة العصبية

ابدأ بفأر مخدر معدل وراثيا مع تثبيت رأسه في محول يحمل الرأس.

يعبر دماغ الفأر عن بروتين فلوري يتيح اكتشاف الأنشطة العصبية.

حلق فروة الرأس وتعقيمها بالتتابع قبل فتحها.

إزالة النسيج الضام لكشف الجمجمة.

ضع علامة على المناطق المستهدفة وقم بتطبيق طبقة من الغراء.

استخدم مثقاب صغير لتخفيف الجمجمة على المنطقة المحددة.

قم بإزالة قطعة الجمجمة لكشف الدماغ.

ضع السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي للحفاظ على رطوبة الدماغ.

قم بتثبيت نافذة بصرية في المنطقة وأغلقها بالغراء ، مما يوفر قاعدة لمرفق الأسمنت.

ضع أسمنت الأسنان الأسود لحجب الضوء.

كرر الإجراء على الجانب الآخر من الجمجمة.

اسمح للحيوان بالتعافي.

لتصوير النشاط العصبي ، ضع الفأر المخدر الآمن تحت المجهر واحصل على الصور.

تأكد من عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم على فأر مخدر من 20 إلى 25 جراما ، و 1 و 1/2 إلى 2 و 1/2 شهر من Thy1-GCaMP6s وقم بتطبيق المرهم على عيون. ضع الماوس على وسادة تسخين مغطاة بستارة معقمة ، واستخدم محولا لتثبيت الرأس للفئران لتثبيت الرأس. احلق معظم فروة الرأس باستخدام ماكينة حلاقة ذات حدين ، ونظف الجلد المكشوف باستخدام ضمادات تحضير الكحول المعقمة المتسلسلة ومقشرات محلول بوفيدون واليود. ثم استخدم مقصا لعمل قطع مستطيل 2 × 3 ملم في فروة الرأس.

باستخدام قطعة قطن ، ادفع الجلد جانبا لإنشاء منطقة تعرض يزيد قطرها عن 3 ملليمترات ، واستخدم شفرة جراحية مجهرية غير حادة لإزالة النسيج الضام المتصل بالجمجمة برفق. باستخدام مثقاب الأسنان ، ضع علامة برفق على دائرة قطرها 3 ملم حول منطقة S1. بعد عمل دائرة مماثلة على الجانب الأيسر من الجمجمة ، ضع طبقة رقيقة من الغراء السيانواكريليت الفائق على جانبي العظم لتوفير قاعدة لتطبيق الأسمنت للأسنان.

تحت مجهر تشريح ، استخدم مثقابا دقيقا عالي السرعة لتخفيف أخدود دائري في الجانب الأيمن من الجمجمة حول منطقة S1 لإنشاء حافة ناعمة ، وشفط بقايا العظام بفراغ حسب الضرورة. بعد تحقيق عمق عظمي يبلغ حوالي 2/3 ، قم بترقيق الثلث المتبقي من العظام ببطء وحذر حتى يتم تحرير سديلة عظمية دائرية تماما من الجمجمة المحيطة. استخدم زوجا من الملقط # 5/45 لإزالة قطعة العظم الدائرية ببطء وبعناية لفضح الجافية ، مع الحرص على تجنب إتلاف أوعية اللحوم.

بعد إزالة السديلة العظمية من الجانب الأيسر من الجمجمة بنفس الطريقة ، اشطف النافذة البصرية للجانب الأيمن من الجمجمة بمحلول ملحي معقم وتحقق من وجود عيوب تحت المجهر المجسم. قم بتثبيت النافذة البصرية فوق منطقة حج القحف مع وضع الجزء العلوي من النافذة على الجمجمة والجزء السفلي داخل الفتحة المجفرة ، مع الاستلقاء على الجافية في وجود السائل النخاعي الدماغي. استخدم الغراء الفائق cyanoacrylate لإغلاق الجزء العلوي من حافة النافذة البصرية بالجمجمة.

عندما يجف الغراء ، ضع أسمنت الأسنان الأسود على حافة الزجاج ، وبقية الجانب الأيمن من الجمجمة المكشوفة ، وهوامش الجرح لحجب الضوء. بعد ذلك ، قم بتثبيت النافذة البصرية اليسرى واسمح للحيوان بالتعافي مع المراقبة حتى الاستلقاء الكامل. بعد 7 إلى 10 أيام من الإجراء ، ضع المخدر في محول تثبيت الرأس على وسادة تسخين ، تحت مجهر ثنائي الفوتون ، مع الحرص على توجيه النافذة البصرية والجانب الأيمن من الجمجمة بشكل عمودي على المحور البصري للمجهر.

احصل على صورة خريطة مرجعية أولية لنافذة الجمجمة باستخدام إضاءة المجال الساطع عند التكبير 4 مرات. بعد الحصول على صور متعددة لنفس منطقة الاهتمام ، قم بتصوير ديناميكيات الكالسيوم داخل منطقة S1 في نصف الكرة الأيسر واحسب التغيرات في التألق من كل منطقة ذات أهمية على جانبي الجمجمة.