موسوعة JoVE للتجارب
Neuroscience
0 مشاهدة • 3:18 دقيقة • June 17th, 2025
خذ الخلايا العصبية القشرية الأولية للقوارض المزروعة على طبق زجاجي مغلف يحتوي على وسائط.
تعبر هذه الخلايا عن بروتين مرتبط بمرض التصلب الجانبي الضموري مشفرا وراثيا ومستشعر حيوي للكالسيوم.
استبدل الوسائط بمخزن مؤقت منخفض كلوريد البوتاسيوم.
احتضان للحفاظ على نشاط الخلايا العصبية أثناء الراحة ومستويات الكالسيوم الأساسية.
قم بتركيب الطبق على مرحلة المجهر متحد البؤر ووضع أنبوب التروية.
باستخدام إضاءة المجال الساطع ، ركز على الخلايا العصبية ، ثم انتقل إلى التصوير الفلوري.
باستخدام ليزر المجهر ، قم بإثارة المستشعر الحيوي وتسجيل انبعاث التألق لتحديد مستويات الكالسيوم داخل الخلايا الأساسية.
بعد ذلك ، قم بتغذية الطبق بمحلول كلوريد البوتاسيوم العالي.
يعمل تركيز البوتاسيوم العالي على إزالة استقطاب الخلايا العصبية ، وفتح قنوات الكالسيوم ذات الجهد الكهربائي في أطراف ما قبل المشبكي. هذا يسمح بتدفق الكالسيوم ، الذي يبدأ النشاط المشبكي العصبي.
يرتبط الكالسيوم المتزايد داخل الخلايا بالمستشعر الحيوي ، مما يتسبب في حدوث تغيير توافقي يعزز التألق.
استمر في تسجيل التألق لقياس التغيرات في الوقت الفعلي في مستويات الكالسيوم داخل الخلايا ، مما يكشف عن النشاط المشبكي العصبي.
بعد48 ساعة من التعدي باستخدام GCaMP6m ، احتضن الخلايا العصبية القشرية الأولية للقوارض مع انخفاض كلوريد البوتاسيوم ACSF لمدة 15 دقيقة. ثم قم بتركيب الطبق على منصة التصوير وتصور مضان GCaMP6m باستخدام مرشح FITC وهدف 20 مرة أو 40 مرة. بعد تحديد مجال التصوير وإشراك التركيز البؤري المثالي ، التقط صورة ثابتة واحدة مع قنوات FITC للمجال الساطع وعلامات التألق لتحديد حدود الخلايا العصبية.
بعد ذلك ، ابدأ "تشغيل الآن" في برنامج الاستحواذ وقم بإجراء التسجيل الأساسي لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. ثم قم ببث ACSF الذي يحتوي على 50 مللي مولار كلوريد البوتاسيوم إلى الخلايا العصبية كما هو موضح سابقا ، وقم بالتسجيل لمدة خمس دقائق. عندما يتوقف الحصول على الصورة ، احفظ التجربة وانتقل إلى تحليل البيانات باستخدام البرنامج متحد البؤر.
لتحليل الصور ، افتح الصور ذات اللقطات المتتابعة والبرنامج متحد البؤر ، وقم بمحاذاة الصور بالنقر فوق الصورة ، متبوعا بالمعالجة ، متبوعا بمحاذاة المستند الحالي. ثم حدد Align to the First Frame. حدد مناطق الاهتمام على طول الخلايا العصبية باستخدام أداة تحديد عائد الاستثمار ، وقم أيضا بتمييز عائد الاستثمار الذي يمثل شدة مضان الخلفية. بعد ذلك ، ابدأ وظيفة القياس من لوحة قياس الوقت لقياس التألق الخام بمرور الوقت لعائد الاستثمار المحدد. بعد القياس ، قم بتصدير شدة التألق الخام إلى برنامج جدول البيانات.