What factors maintain embryonic stem cells in an undifferentiated state?

Embryonic stem cells require specific factors in their growth medium to suppress spontaneous differentiation and retain pluripotency. Feeder cells, typically mouse embryonic fibroblasts (MEFs), provide factors like activin A that maintain ES cells undifferentiated. Alternatively, feeder-free methods use defined media recipes with necessary factors added directly, reducing variability and enabling clinical applications.

Why do human embryonic stem cells require mechanical picking during passaging?

Human ES cells naturally grow in clusters and have low survival rates when dissociated into single cells. Mechanical picking preserves intact cell clumps, maintaining viability during passaging. This approach contrasts with feeder-free methods using ROCK inhibitors, which allow single-cell suspension passaging at high density while improving cell survival and reducing culture heterogeneity.

What is the hanging drop method used for in embryonic stem cell differentiation?

The hanging drop method directs ES cell differentiation into specific cell types by forming embryoid bodies (EBs). ES cells are suspended in media containing lineage-specific differentiation factors and deposited as drops on inverted petri dish lids. After two days, EBs are collected and plated onto non-adherent plates, then transferred to adherent dishes at appropriate timepoints for further differentiation.

How can embryonic stem cells be directed to differentiate into specific cell types?

Scientists direct ES cell differentiation by varying culturing conditions and adding specific growth factors to the medium. For example, motor neurons are produced by first adding factors that direct embryoid bodies toward the neural lineage, followed by chemicals and plating conditions that specify motor neuron identity. Similar approaches have successfully generated rhythmically beating heart muscle cells.

What are embryoid bodies and how do they form?

Embryoid bodies (EBs) are three-dimensional aggregates that form when ES cells grow in non-adherent conditions. Within EBs, ES cells differentiate into multiple cell types, mimicking early embryonic development. By controlling differentiation conditions and growth factors, researchers can direct EB development toward specific cell lineages for regenerative medicine applications.

What is pluripotency and why is it important for embryonic stem cell research?

Pluripotency is the ability of ES cells to differentiate into almost any cell type found in the body. This unique property allows researchers to generate specialized cells for studying embryonic development and developing treatments for degenerative diseases. Maintaining pluripotency requires culturing ES cells with specific factors that suppress spontaneous differentiation.

How do scientists study early embryonic development using differentiated embryonic stem cells?

Because differentiating ES cells mimic events occurring during natural embryonic development, researchers use them to investigate developmental biology. For instance, scientists study X-chromosome inactivation (XCI) by visualizing specific RNAs and proteins in developing embryoid bodies. This approach provides valuable insights into crucial developmental processes without requiring intact embryos.

زراعة الخلايا الجذعية الجنينية والتمايز

0 مشاهدة09:52 دقيقة

الخلايا الجذعية الجنينية ، أو الخلايا الجذعية الجنينية ، لها عدد من الخصائص الفريدة التي تميزها عن الخلايا البالغة العادية. لذلك ، ابتكر العلماء تقنيات استزراع خاصة للحفاظ على هذه الخصائص أو الاستفادة منها. عند زراعتها بشكل صحيح ، يمكن للخلايا الجذعية الجنينية أن تنقسم إلى أجل غير مسمى لتكوين المزيد من نفسها. في الوقت نفسه ، من خلال تغيير ظروف الاستزراع ، يمكن توجيه الخلايا الجذعية الجنينية للتمايز إلى أي نوع من الخلايا الموجودة في أجسامنا تقريبا. تسمى قدرة الخلايا الجنينية هذه "تعدد القدرات".

في هذا الفيديو ، ستتعلم كيفية زراعة الخلايا الجذعية الجنينية ومرورها بحيث تحافظ على خصائصها الفريدة ، وكيفية إحداث التمايز في الخلايا الجذعية الجنينية لتشكيل أنواع معينة من الخلايا ، والطرق التي يتم بها استخدام تقنيات زراعة الخلايا الجذعية الجنينية وتمايزها وتحسينها من قبل الباحثين اليوم.

قبل الخوض في تفاصيل إجراءات صيانة الخلايا الجذعية الجنينية ، من المهم أولا فهم ما الذي يمنع أو يدفع تمايز الخلايا الجذعية الجنينية أو يدفعها. لكي تحتفظ الخلايا الجذعية الجنينية بخصائصها الفريدة المتمثلة في تعدد القدرات والتجديد الذاتي ، يجب زراعتها بعوامل محددة في وسط نموها تثبط التمايز التلقائي.

يتم ذلك بشكل شائع عن طريق زراعة الخلايا الجذعية الجنينية على طبقة من "المغذيات" ، وعادة ما تكون الخلايا الليفية الجنينية للفأر ، أو MEFs. تقوم الخلايا المغذية "بإغذاء" الخلايا الجذعية الجنينية بعوامل معينة ، مثل أكتيفين أ ، التي تساعد في الحفاظ على الخلايا الجذعية الجنينية في حالتها غير المتمايزة.

في الآونة الأخيرة ، طور العلماء أيضا طرق استزراع خالية من المغذيات حيث تزرع الخلايا الجذعية الجنينية في وسائط مع إضافة العوامل الضرورية في وصفة محددة. يقلل هذا النهج من التباين ويزيل المكون غير البشري من مزارع الخلايا الجذعية الجنينية ، وهو شرط أساسي للتطبيقات السريرية.

من السمات الأخرى للخلايا الجذعية الجنينية أنها تنمو بشكل طبيعي في مجموعات أو مستعمرات ، وتميل إلى أن يكون لها معدل بقاء منخفض عند تفكيكها إلى خلايا مفردة ، وخاصة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. نتيجة لذلك ، يتطلب مرور الخلايا الجذعية الجنينية البشرية عموما الاحتفاظ بها في كتل سليمة من خلال "الانتقاء" الميكانيكي.

عندما تنمو الخلايا الجذعية الجنينية في ظروف غير ملتصقة ، فإنها تشكل مجاميع ثلاثية الأبعاد تعرف باسم الأجسام الجنينية ، أو EBs ، حيث تتمايز الخلايا الجذعية الجنينية إلى جميع أنواع الخلايا المختلفة. من خلال تغيير ظروف التمايز ، مثل إضافة عوامل نمو محددة إلى الوسط ، يقوم العلماء بتطوير طرق لتوجيه تمايز الخلايا الجذعية الجنينية إلى أنواع معينة من الخلايا.

الآن بعد أن فهمت المبادئ الكامنة وراء صيانة الخلايا الجذعية الجنينية وتمايزها ، دعنا نلقي نظرة على كيفية زراعة الخلايا الجذعية الجنينية ومرورها على مغذيات MEF.

يتم الحصول على MEFs من أجنة الفئران في المراحل المبكرة ، ثم يتم تعطيلها بواسطة المواد الكيميائية أو الإشعاع لمنعها من الانقسام. يجب طلاء MEFs المعطلة على أطباق زراعة الأنسجة الجيلاتينية قبل يوم واحد على الأقل من البدء في زراعة الخلايا الجنينية الجنينية. عندما يتم تسوية المغذيات بالكامل ، يتم إذابة الخلايا الجذعية الجنينية وبذرها على الألواح.

خلال الأيام القليلة المقبلة ، ستنمو الخلايا الجنينية الجنينية إلى مستعمرات كبيرة. قبل أن تبدأ المستعمرات في اللمس والاندماج ، يجب تمرير ثقافة ES. يجب على المرء أن يلاحظ مورفولوجيا الخلايا الجذعية الجنينية لمعرفة ما إذا كانت تظهر عليها علامات التمايز. تبدو مستعمرات ES غير المتمايزة بشكل عام محددة جيدا ومتجانسة ، بينما تبدو الخلايا المتمايزة مثل "أحجار مرصوفة بالحصى" باهتة وغير منتظمة الشكل.

إذا أظهرت المستعمرات 70٪ أو أكثر من التمايز ، أو إذا كانت متناثرة ، فقم بقطع المستعمرات غير المتمايزة ميكانيكيا ونقلها إلى لوحة تغذية جديدة. خلاف ذلك ، ما عليك سوى إزالة المناطق أو المستعمرات المتمايزة والمضي قدما في المرور.

بمجرد تنظيف المستعمرات المتمايزة ، تتم إضافة الإنزيمات المحللة للبروتين ، مثل الكولاجيناز ، لرفع الخلايا من الصفيحة مع الحضانة عند 37 درجة مئوية لفترة زمنية مناسبة. ثم تتم إضافة وسائط ES جديدة لإيقاف التفاعلات الأنزيمية. يتم إزاحة المستعمرات ميكانيكيا من اللوحة ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي ، حيث يتم تقسيمها إلى الأحجام المرغوبة باستخدام سحب العينات اللطيف. يتم جمع خلايا ES عن طريق الطرد المركزي ، وإعادة تعليقها في وسائط ES ، وطلاءها على ألواح التغذية المعدة.

بعد تعلم كيفية تمرير الخلايا الجنينية الجنينية ، دعنا نلقي نظرة على إحدى التقنيات الأكثر شيوعا المستخدمة لتفريق الخلايا الجنينية إلى أجسام جنينية - طريقة السقوط المعلق.

للبدء ، يتم فصل الخلايا الجذعية الجنينية بمساعدة الإنزيمات المحللة للبروتين مثل الكولاجيناز ، وتخفيفها إلى التركيز المطلوب في الوسائط التي تحتوي على عوامل تمايز خاصة بالنسب. ثم يتم ترسيب معلق الخلية ES في قطرات على غطاء طبق بتري بكتيري. يتم قلب الغطاء بسرعة ووضعه على الطبق ، لذلك تتدلى قطرات الوسائط رأسا على عقب وتسمح للأجسام الجنينية بالنمو.

بعد حوالي يومين ، يمكن جمع القطرات التي تحتوي على EBs وطلاءها على ألواح غير ملتصقة لمزيد من الزراعة. في النقطة الزمنية المناسبة لنسب الخلية المطلوبة ، يتم طلاء الأجسام الجنينية مرة أخرى على أطباق زراعة الأنسجة الملتصقة الجيلاتينية لمزيد من التمايز.

الآن بعد أن غطينا التقنيات الأساسية لزراعة الخلايا الجنينية الجنينية وتمايزها ، دعنا نلقي نظرة على كيفية تخصيصها لتلبية الاحتياجات التجريبية المحددة.

كما ذكرنا سابقا ، يمكن توجيه الخلايا الجذعية الجنينية للتمايز إلى أنواع معينة من الخلايا في ظل ظروف استزراع مختلفة. في هذه التجربة ، أنتج العلماء الخلايا العصبية الحركية من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. تم ذلك عن طريق إضافة عوامل أولا للتمييز بين الأجسام الجنينية التي توجهها نحو النسب العصبي ، تليها المواد الكيميائية وظروف الطلاء التي تحول هذه الخلايا على وجه التحديد إلى خلايا عصبية حركية. باستخدام أساليب مماثلة ، نجح الباحثون في تمييز الخلايا الجذعية الجنينية إلى خلايا عضلة القلب النابضة بشكل إيقاعي.

نظرا لأن تمايز الخلايا الجنينية الجنينية يحاكي الأحداث التي تحدث مع تطور الأجنة بشكل طبيعي ، يمكننا أيضا استخدامها للتحقيق في بيولوجيا التطور الجنيني المبكر. إحدى الظواهر التي تتم دراستها هي تعطيل الكروموسوم X ، أو XCI ، وهي العملية الحاسمة التي يتم من خلالها إسكات أحد الكروموسومين X في كل خلية من الثدييات الأنثوية. من خلال تصور توزيع الحمض النووي الريبي والبروتينات المحددة في تطوير EBs ، اكتسب العلماء رؤى قيمة في بيولوجيا XCI.

أخيرا ، لزيادة اتساق وكفاءة تجارب الخلايا الجذعية الجنينية ، يحاول العلماء باستمرار ابتكار تقنيات أفضل لزراعة الخلايا الجذعية الجنينية. تتمثل إحدى الطرق في زراعة الخلايا الجذعية الجنينية في طبقة واحدة ، تسمى زراعة أحادية الطبقة من النوع غير المستعمري ، أو NCM.

هل تتذكر أن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية تميل إلى أن تكون غير سعيدة عندما لا تنمو كمجاميع ثلاثية الأبعاد؟ أظهر العلماء أن المواد الكيميائية المعروفة باسم مثبطات ROCK تزيد من بقاء الخلايا الجذعية الجنينية المنفصلة ، مما يسمح لها بالمرور كمعلقات أحادية الخلية ، وأن يتم طلاؤها بكثافة عالية. تتمثل ميزة تقنية NCM في أن كل خلية ستكون أكثر تعرضا بشكل متساو لعوامل النمو والعناصر الغذائية في الوسط ، مما يقلل من عدم التجانس داخل الثقافة مع تسهيل نمو الخلايا الجذعية الجنينية بأعداد كبيرة.

لقد شاهدتم للتو فيديو JoVE حول كيفية زراعة الخلايا الجذعية الجنينية وتمايزها. يجب أن تعرف الآن العوامل المهمة للحفاظ على الخلايا الجنينية الجنينية في حالتها غير المتمايزة ، وكيف يمكننا الاستفادة من تعدد القدرات في الخلايا الجذعية الجنينية لتوليد أنواع معينة من الخلايا في طبق. من الآن فصاعدا ، سيعمل العلماء على تطوير ظروف زراعة وتمايز أكثر كفاءة وتحديدا جيدا لإنتاج أنواع خلايا متخصصة يمكن استخدامها في تطبيقات الطب التجديدي. شكرا للمشاهدة!

تتطلب زراعة الخلايا الجذعية الجنينية (ES) ظروفا تحافظ على هذه الخلايا في حالة غير متمايزة للحفاظ على قدرتها على التجديد الذاتي وتعدد القدرات. يعمل علم…