How do genome editing techniques create targeted mutations in DNA?

Genome editing methods use engineered nuclease enzymes to create small cuts or double-strand breaks in specific DNA sequences. Cells attempt to repair this damage through nonhomologous end joining or homology-directed repair. During repair, mutations are introduced into the targeted region with much higher efficiency than classical gene targeting methods.

What is the difference between NHEJ and HDR in DNA repair?

Nonhomologous end joining (NHEJ) directly reseals broken DNA ends but often imperfectly, deleting or adding bases and mutating the target sequence. Homology-directed repair (HDR) fixes damage by copying from a homologous template, allowing researchers to add specific sequences to direct precise changes at the target site.

How do zinc finger nucleases and TALENs differ in their targeting approach?

Zinc finger nucleases (ZFNs) fuse DNA-binding zinc finger domains to the FokI endonuclease, with each domain recognizing a specific nucleotide triplet. TALENs join FokI to bacterial transcription activator-like effector domains, where each domain recognizes a single unique DNA base, providing different levels of sequence specificity.

Why is the CRISPR-Cas9 system advantageous compared to protein-based genome editing methods?

The CRISPR-Cas9 system uses customizable RNA guide sequences called single guide RNAs (sgRNAs) to target Cas9 to desired genetic sequences. This RNA-based approach provides distinct advantages over protein-based methods like ZFNs and TALENs because the guide sequence can be easily modified to target almost any genomic location in mammalian cells or other systems.

What role does the protospacer adjacent motif play in CRISPR-Cas9 targeting?

The protospacer adjacent motif (PAM) is a 3-base pair sequence located at the 3' end of the target DNA region. Cas9 requires the PAM to recognize and cleave the target DNA, and the exact PAM sequence is specific to the organism from which the Cas9 enzyme originated, making it essential for successful genome editing.

How are CRISPR guide sequences synthesized and incorporated into cells?

Two complementary oligonucleotides matching the target sequence are synthesized, denatured, and annealed. The resulting guide sequence is ligated into a plasmid containing an sgRNA scaffold using restriction enzymes and ligase. The CRISPR construct is then co-transfected with a Cas9-encoding construct into target cells, which are cultured and screened by PCR or sequencing for desired mutations.

What are some current applications of genome editing in research?

Researchers use genome editing to insert reporter sequences like green fluorescent protein into specific genes, generate knockout organisms where genes are rendered non-functional, and create large genetic deletions by inducing two double-strand breaks in the same chromosomal region. These applications enable study of gene function and disease mechanisms in model organisms and cultured cells.

تحرير الجينوم

0 مشاهدة08:31 دقيقة

يشتمل تحرير الجينوم على تقنيات يمكن للباحثين من خلالها "تحرير" أو تغيير تسلسل DNA معين. تعتمد هذه الأساليب على إنشاء "جروح" صغيرة في الحمض النووي ، والتي تحاول الخلايا إصلاحها ، غالبا بشكل غير كامل. بهذه الطريقة ، يمكن للعلماء إحداث طفرات في التسلسلات المستهدفة بكفاءة أكبر مقارنة باستهداف الجينات الكلاسيكية.

في هذا الفيديو ، سنراجع المبادئ الكامنة وراء ثلاث تقنيات لتحرير الجينوم ، ونناقش بروتوكولا معمما لأحدها ، وهو نظام CRISPR-Cas9. سنستكشف بعد ذلك بعض تطبيقات هذه الأساليب.

أولا ، دعونا نلقي نظرة على المبادئ الكامنة وراء تحرير الجينوم.

الطريقة الكلاسيكية لإدخال التغييرات الجينية على تسلسلات معينة في الجينوم هي استهداف الجينات عن طريق إعادة التركيب المتماثل ، حيث يؤدي دمج التسلسلات المتجانسة في بنية الاستهداف إلى "تبديل" الجين الداخلي لنسخة معدلة.

مثل استهداف الجينات ، يمكن لتحرير الجينوم استهداف التغييرات في مناطق معينة من الحمض النووي ، ولكن يمكنه القيام بذلك بكفاءة أعلى بكثير ، مما يؤدي إلى إنشاء الطفرات المرغوبة في المزيد من الخلايا في أي تجربة معينة.

تعتمد جميع طرق تحرير الجينوم على قدرة الخلية على إصلاح الفواصل المزدوجة التي تحدث إلى الحمض النووي الخاص بها بواسطة نوكليازات داخلية. يمكن إصلاح هذا الضرر عن طريق الانضمام النهائي غير المتماثل أو NHEJ ، حيث يتم إعادة إغلاق نهايات الحمض النووي المكسورة مباشرة ؛ أو عن طريق الإصلاح الموجه بالتماثل أو HDR ، حيث يتم إصلاح الضرر عن طريق النسخ من قالب متماثل. لا يكون NHEJ مثاليا عادة ، ويمكن أن يؤدي إلى حذف العديد من القواعد أو إضافتها إلى الحمض النووي الذي تم إصلاحه ، وبالتالي تغيير التسلسل المستهدف. من ناحية أخرى ، يسمح HDR للباحثين بإضافة قالب لتوجيه تغييرات محددة إلى الموقع المستهدف.

تم تطوير ثلاث تقنيات رئيسية لتحرير الجينوم وتعميمها خلال السنوات القليلة الماضية.

في إحدى الطرق ، يدمج الباحثون مجالات "إصبع الزنك" المرتبطة بالحمض النووي لعوامل نسخ معينة في مجال شق الحمض النووي ل Fok I endonuclease. نظرا لأن كل مجال إصبع من الزنك يتعرف على ثلاثة توائم معينة من النيوكليوتيدات ، يمكن ربط هذه المجالات معا بشكل مصطنع لهندسة نوكليازات إصبع الزنك ، أو ZFNs ، التي تستهدف تسلسلات الحمض النووي الفريدة.

وبالمثل ، تنضم نوكليازات تسمى "TALENs" إلى FokI إلى مجالات ربط الحمض النووي المتغيرة للبروتينات البكتيرية التي تسمى المؤثرات الشبيهة بمنشط النسخ ، أو TALEs. يتعرف كل مجال TALE على قاعدة DNA واحدة وفريدة من نوعها ، مما يمنح TALENs خصوصية تسلسلها.

أخيرا ، يستخدم نظام CRISPR-Cas9 مكونات جهاز المناعة بدائية النواة الذي يحمي مضيفه عادة من توغل المواد الوراثية الغريبة ، مثل تلك الموجودة في الفيروسات أو البلازميدات. في هذا النظام ، يتم دمج قطع من الحمض النووي الغريب الغازي المسماة "protospacers" في موضع CRISPR ، والذي يتم بعد ذلك نسخه ومعالجته بواسطة آلية البروتين والحمض النووي الريبي إلى RNAs صغيرة تسمى crRNAs.

يقوم العلماء بتسخير آلية كريسبر لأغراض التحرير الجينومي من خلال تصميم تسلسلات إرشادية تشبه crRNA تعرف باسم "الدليل الفردي" أو sgRNA ، والتي يمكن استخدامها لاستهداف Cas9 إلى أي تسلسل جيني مرغوب فيه تقريبا في خلايا الثدييات ، أو غيرها من الأنظمة ذات الأهمية. توفر قابلية التخصيص البسيطة لنظام CRISPR-Cas9 القائم على تسلسل الحمض النووي الريبي مزايا مميزة مقارنة بطرق تحرير الجينوم القائمة على البروتين مثل ZFNs و TALENs.

الآن بعد أن تعرفت على المبادئ الكامنة وراء تحرير الجينوم ، دعنا نراجع بروتوكولا نموذجيا لاستخدام كريسبر لإنشاء تغييرات جينية مستهدفة في خلايا الثدييات.

أولا ، يتم اختيار موقع جيني ليتم تحريره. يجب أن تكون هذه المنطقة قصيرة - حوالي 20 زوجا أساسيا في الحجم - وتمتلك 3 أزواج من القواعد "الشكل المجاور للفاصل الأولي" أو "PAM" في نهايته 3. PAM مطلوب ل Cas9 للتعرف على منطقة الحمض النووي المستهدفة وشقها ، والتسلسل الدقيق خاص بكائن المنشأ ل Cas9 المستخدم. بمجرد تحديد موقع محتمل ، يجب البحث عنه مقابل تسلسل الجينوم للتأكد من عدم العثور على مواقع مماثلة في أي مكان آخر في الجينوم ، وبالتالي لن يتم تحرير أي مناطق جينومية غير مستهدفة.

لتجميع تسلسل دليل كريسبر ، يتم إنشاء اثنين من قليل النوكليوتيدات ، أحدهما متطابق والآخر مكمل للتسلسل المستهدف. يتم تضمين تسلسلات إضافية على نهاياتها 5 للتوافق مع متجهات sgRNA. ثم يتم خلط هذه قليل النوكليوتيدات معا ، وتغيير طبيعتها ، ثم تلدينها.

بعد ذلك ، يتم قطع البلازميد الذي يحتوي على "سقالة" sgRNA بإنزيم التقييد المناسب ، وخلطه مع تسلسل دليل CRISPR المركب ، ويتم احتضانه بإنزيم ligase لإنشاء بنية sgRNA. يمكن بعد ذلك تحويل البلازميد إلى بكتيريا وزراعته لتضخيمه. بمجرد تنقيتها من البكتيريا ، يتم نقل بنية CRISPR بشكل مشترك مع بنية تشفير Cas9 في الخلايا التي سيتم تحرير جينومها. يتم زراعة هذه الخلايا المنقولة لتشكيل مستعمرات نسيلية.

يمكن عزل الحمض النووي الجيني من كل مستعمرة وتحليله عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل أو التسلسل للكشف عن تلك التي أنتج فيها نظام كريسبر الطفرات المطلوبة.

دعونا الآن نلقي نظرة على بعض الطرق التي يستخدم بها العلماء تقنيات تحرير الجينوم.

يستخدم العديد من الباحثين تحرير الجينوم لإدخال تسلسل المراسلين في مواقع محددة. في هذه التجربة ، تم استخدام ZFNs لإدخال بروتين الفلورسنت الأخضر في الجين الذي يشارك في تطوير الخلايا العصبية وبقائها. أكد الباحثون أنهم استهدفوا هذا الجين بشكل صحيح عن طريق توجيه الخلايا الجذعية للتمايز إلى خلايا عصبية ، وإجراء تألق مناعي مزدوج ل GFP والعلامات العصبية.

كما جعل تحرير الجينوم من السهل جدا توليد كائنات "بالضربة القاضية" التي يصبح فيها الجين محل الاهتمام غير وظيفي. هنا ، سعى الباحثون إلى إنشاء فئران بالضربة القاضية عن طريق حقن الأجنة باستخدام mRNA الذي يشفر TALENs التي تستهدف جينات معينة. سمح العلاج اللاحق للنوكلياز الداخلي للحمض النووي من الفئران المعالجة ب TALEN للباحثين بتحديد التي لديها طفرات في كلتا النسختين من الجين المستهدف.

أخيرا ، يمكن استخدام تحرير الجينوم لإنشاء عمليات حذف جينية كبيرة عن طريق التسبب في فصيلين مزدوجين في نفس منطقة الكروموسومات. قد تكون عمليات الحذف الكبيرة هذه ضرورية عندما لا يمكن القضاء على وظيفة الجين أو العنصر الجيني من خلال عمليات الحذف الصغيرة التي تم إنشاؤها باستخدام بروتوكولات تحرير الجينوم التقليدية. هنا ، شارك الباحثون في الكهربية خلايا سرطان الفئران مع بنية GFP واثنين من تركيبات كريسبر التي تستهدف مناطق مختلفة داخل جين يقود السرطان. تم عزل الخلايا التي تم نقلها بنجاح ، والتي من شأنها أن تنبعث منها إشارة GFP ، عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة ، وتم تحديد الخلايا اللاحقة PCR والتسلسل التي تم فيها حذف منطقة الحمض النووي بين الموقعين المستهدفين بكريسبر.

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول تحرير الجينوم. هنا ، قمنا بمراجعة المبادئ الكامنة وراء ZFNs و TALENs و CRISPR ، واستكشفنا بروتوكول CRISPR-Cas9 العام ، وناقشنا كيف يستخدم الباحثون تقنيات تحرير الجينوم اليوم. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!

من التقنيات الراسخة لتعديل تسلسلات معينة في الجينوم استهداف الجينات عن طريق إعادة التركيب المتماثل ، ولكن هذه الطريقة يمكن أن تكون شاقة ولا تعمل إلا ف…