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机械通气小鼠中超极化129Xe肺部磁共振成像与波谱分析

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DOI：

10.3791/66924

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2024年10月11日

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1Center for Pulmonary Imaging Research, Division of Pulmonary Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, University of Cincinnati, 3Imaging Research Center, Department of Radiology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 4Analytical Technology Group, Aurorium, 5Division of Pulmonary, Critical Care, and Sleep Medicine, Department of Internal Medicine, University of Kansas Medical Center, 6Department of Bioengineering, University of Kansas, 7Hoglund Biomedical Imaging Center, University of Kansas Medical Center, 8Department of Pediatrics, University of Cincinnati, 9Division of Pulmonary Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

本文内容

摘要

超极化氙磁共振成像可用于转化研究和临床诊疗中定量评估肺部微结构（气腔尺寸）及生理功能（通气与气体交换）。尽管存在技术挑战，该技术在临床前研究中仍可提供可比的肺部功能信息。本方案描述了在小鼠中常规开展氙气肺部磁共振成像所需的基础设备与操作步骤。

摘要

超极化（HP）氙-129（129Xe）是一种可吸入的磁共振成像（MRI）对比剂，具有独特的光谱和物理特性，可用于量化肺部生理功能，包括通气、受限扩散（肺泡气腔大小）以及气体交换。在人体中，该技术已用于评估多种肺部疾病的严重程度和进展，并已获准在美国和英国用于临床。除了临床应用外，129Xe MRI 能够无创地评估肺部病理生理状态，并提供空间分辨的信息，因此在临床前研究中具有重要价值。在动物模型中，小鼠因易于获得基因修饰疾病模型而被最广泛使用。在此背景下，129Xe MRI 作为一种微创、无辐射且高灵敏度的技术，在纵向监测肺部疾病进展及治疗反应（例如药物发现）方面展现出良好前景。通过结合由 MRI 触发的自由呼吸装置或机械通气机输送气体，该技术可拓展至临床前应用。本文描述了相关操作步骤并提供了检查清单，以确保数据采集与分析的可靠性，包括制备用于质量控制的热极化氙气模型、优化极化过程、动物操作（小鼠的镇静、插管、通气及护理），以及通气、受限扩散和气体交换数据的采集方案。尽管临床前 129Xe MRI 可应用于多种动物模型（如大鼠、猪、羊），本方案聚焦于小鼠，因其微小解剖结构带来的技术挑战可通过其成本低廉和丰富的疾病模型资源得以平衡。

引言

尽管肺部疾病仍是全球发病率和死亡率的主要原因1，但过去十年中患者的预后已显著改善。这些进展部分归因于两个因素：首先，III 期临床试验目前优先将肺功能变化作为终点指标，而非死亡率，从而加快了药物试验的进程2,3,4,5；其次，动物模型的不断改进加深了对疾病机制的理解，并推动了治疗策略的开发6,7。小鼠模型在转化研究中常被优先选用，因其在生理上与人类具有相似性，且成本较低、疾病发展迅速。基因工程技术的发展进一步拓展了可用模型的种类和质量，国际小鼠品系资源库目前拥有超过 32,000 种小鼠品系8，而大鼠品系仅有 4,218 种（Rat Genome Database9）。这些模型为研究多种肺部疾病的机制驱动因素和治疗反应开辟了新途径，包括慢性阻塞性肺疾病（COPD）10、囊性纤维化（CF）11、肺纤维化12,13、肺动脉高压14,15以及哮喘16。

遗憾的是，小鼠肺部研究受限于现有的疾病负荷量化技术。研究通常依赖于终端实验方法，这些方法：1）仅能提供全肺信息（如生化检测）或局部信息（如组织学）；2）需要采用横断面设计并耗费大量样本量。因此，这些方法既无法捕捉疾病的空间动态，也无法反映其时间演变。相比之下，无创的三维成像技术能够随时间推移评估肺部的结构、分子过程及功能。

肺部结构（例如气道异常和间质性纤维化）可通过超短回波时间（UTE）磁共振成像（MRI）和高分辨率显微计算机断层扫描（µCT）进行可视化。通过外源性对比剂（例如氙增强CT和氧增强UTE）以及电离辐射核医学方法（即正电子发射断层扫描[PET]和单光子发射计算机断层扫描[SPECT]），可以获得功能性和机制性信息（例如通气、灌注、肿瘤代谢和炎症过程）。然而，由于在不使用高于常规辐射剂量的电离成像方式的情况下，信噪比较低（特别是在用于临床前MRI的高磁场强度下，氧增强UTE的T1延长），功能成像具有挑战性。尽管在动物模型中使用常规剂量进行这些成像方式耐受性良好，但累积辐射可能干扰免疫学、炎症和肺癌研究的结果17。然而，超极化（HP）氙-129（129Xe）磁共振成像（MRI）可提供微创、无电离辐射且高度敏感的结构和功能信息。虽然该技术已在临床前研究中用于表征肺气肿18,19、纤维化20、肺癌21、慢性阻塞性肺疾病（COPD）22以及放射性肺损伤23等多种疾病在单个或多个时间点的特征，但在临床前研究中的应用仍显不足。

为了实现常规的临床前 129Xe MRI 需要满足多个先决条件，包括机构监管支持、超极化设备以及一台 129Xe调谐射频（RF）线圈，以及多核兼容型扫描仪。尽管高级应用24,25,26,27,28,29,30,31,32,33 需要供应商特定的脉冲编程，这超出了本实验方案的范围，但通过适度的软件修改即可实现基本应用。因此，我们重点介绍专属于以下方面的质量控制、磁化处理、数据采集和动物操作流程——包括机械通气—— 临床前 129Xe MRI（图1).

迄今为止，小动物129Xe成像已采用三种磁共振兼容的气体输送方法，每种方法各有优缺点：自由呼吸法、活塞驱动法和压力降法。自由呼吸法允许动物自发吸入气体，避免了气管插管或气管切开可能造成的损伤风险，但会显著消耗更多超极化气体，并可能引入运动伪影34,35。商用活塞驱动装置具有自校准功能，开箱即用、操作简便，但价格可能过于昂贵36。本文所采用的压力降方法在文献中已有充分描述，具有模块化、可定制的特点，并由开源代码控制运行37,38,39,40。此外，该方法成本效益高，总成本通常低于1万美元，且仅需数周集中构建时间。压力降式呼吸机可在监测插管小鼠气道压力的同时，将129Xe从加压容器内的剂量袋中输送至动物体内。

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图1：在小鼠中采集常规氙-129（129Xe）磁共振成像（MRI）的实验流程概览。（A）初始设置步骤。（注：扫描仪编程因各厂商而异，本方案中未予描述）。（B）每日质量保证（QA）及动物数据采集步骤。（C） 实验成功完成及数据分析的步骤。请点击此处查看此图的放大版本。

本文中，我们采集并分析129Xe MRI 数据的三类常见形式：通气成像、扩散加权成像（肺泡气腔尺寸）和气体交换成像。通气图像可显示吸入的129Xe气体在肺内的分布情况。肺部气流减少的区域在超极化气体图像中呈现为暗区，病理学特征通过通气缺陷体积进行量化。在人体研究中，通气缺陷百分比（VDP）已显示出良好的重复性41,42，并对慢性阻塞性肺疾病（COPD）43,44,45 和哮喘46,47 等疾病中的气道阻塞具有高敏感性。

通过表观扩散系数（ADC）可以测量129Xe原子在气道腔隙中的受限扩散，该参数可作为气腔大小的替代指标。ADC的计算方法是获取一幅无扩散加权的基线图像（b0），以及一幅或多幅在双极梯度诱导的扩散加权条件下获得的图像（bN）。升高的ADC值反映由于衰老或肺气肿样重塑导致的气腔增大 18,48。此外，使用多个b值图像（≥4）可进一步计算出更详细的形态计量学信息（如平均线性截距）49,50。

由于以下两个原因，可以对气体交换进行表征：1）129Xe 在毛细血管膜组织、血浆和红细胞（RBCs）中的溶解度；以及 2）129Xe 溶解于这些隔室时产生 >200 ppm 的去屏蔽化学位移。光谱学和成像数据均可为心肺疾病（例如肺动脉高压和左心衰竭51,52,53）提供深入信息。尽管许多物种（人类、犬类和大鼠）在每个隔室中均表现出独特的光谱峰，但由于血红蛋白与氙结合位点相互作用的差异，小鼠缺乏独特的红细胞信号。相反，在小鼠中所有溶解组分合并为单一信号54。然而，在表达人源血红蛋白的转基因小鼠（如镰状细胞病模型中使用的小鼠）中，可以观察到明显的红细胞共振信号54。总体而言，溶解态129Xe 的光谱学与成像技术为小鼠心肺病理生理学提供了独特的研究视角55,56。

在尝试本方案之前，必须了解有关小鼠研究所需的磁共振成像（MRI）扫描仪、机械通气及小鼠操作技术的背景信息。在开展动物实验前，所有操作步骤必须获得当地机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准57。由于小鼠肺部固有的磁矩总量较低（即潮气量约为250 µL），为达到与人体解剖结构相当的分辨率，体素尺寸必须比人类小1000倍。小鼠的呼吸频率也非常快（>100次/分钟）。因此，通常用于人体成像的单次屏气扫描方法并不可行。相反，每次呼吸期间只能施加少数几次射频激发，因此129Xe图像必须在数十至数百次呼吸过程中进行编码。可能需要进行脉冲编程，以允许外部触发数据采集，并在平衡信噪比（SNR）、分辨率和扫描时长的前提下，正确循环切片、相位编码和/或扩散加权图像。 在此方案中，呼吸机每呼吸一次输出一个晶体管-晶体管逻辑（TTL）脉冲，用于触发数据采集（图2）。

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图 2：代表性机械通气与数据采集时序。（A）由用户控制的通气可在吸气末、屏气期间或呼气末触发数据采集。（B）对于此三维径向通气序列，用户需设定采集的总投影数以及每次呼吸采集的投影数。（C）对于层面选择性的二维扩散加权成像，用户需设定层面顺序、b值图像以及相位编码顺序。请点击此处查看此图的放大版本。

为了实现可靠的通气和 129Xe输送，必须进行有效的镇静和气管插管操作。在每项研究中，都需要考虑每种麻醉剂的下游效应——包括每分钟通气量、心率（HR）和血压的变化58,59,60,61,62,63,64,65,66。尽管已有多种镇静剂用于临床前超极化气体MRI研究，但我们采用的是氯胺酮、赛拉嗪和乙酰丙嗪的混合制剂，因其可及性强、成本低、效果可靠且作用时间适宜67,68。动物在镇静后必须进行气管插管，以实现有效的机械通气。由于小鼠解剖结构较小，对其进行插管操作较为困难，因此充分掌握该技术的训练至关重要。我们建议研究人员参考已发表的视频操作方案69,70。由于大多数商用插管导管含有不锈钢材料，我们介绍一种制备无金属（即兼容MRI和超极化气体）楔形导管的技术，该导管可定制以匹配气道直径，从而与小鼠气管壁形成密闭密封。

由于129Xe 图像需在多次呼吸过程中采集，呼吸机参数设置至关重要。必须谨慎考虑保护性通气策略，以防止肺损伤71,72,73,74。特别是采用低潮气量（TV）、适度的呼气末正压（PEEP）以及肺泡复张手法（RMs），可在人类患者和动物模型中降低呼吸机相关性肺损伤的风险75,76,77,78,79,80,81。本文推荐一种简单的方法，适用于压力下降型129Xe机械通气，既具有肺保护作用，又能提供足够的129Xe图像信噪比（SNR）。具体而言，我们通过在呼吸机呼气管路中加装商用PEEP阀来实现PEEP。实施肺泡复张手法（RMs）时，必须关闭呼气管路，使动物在不呼气的情况下连续进行多次吸气，直至达到预设的压力和持续时间。

在整个过程中，我们提供了通用的通气参数设置，但建议查阅相关文献以针对特定研究目标进行调整82,83。除了在机械通气期间监测气道峰压外， 监测动物体温也十分重要，可采用常规的小鼠体温监测方法进行。虽然心电图（ECG）监测并非成像所必需，但具有潜在优势；ECG 可提示动物是否从镇静状态苏醒、药物过量或出现应激反应，从而便于研究人员及时干预。

本文所述方案旨在采集129Xe 3D径向通气数据61、2D GRE扩散加权数据76以及动态脉冲采集光谱气体交换数据。该方案旨在弥合小型动物模型的临床前研究与129Xe MRI在推进肺部疾病认知方面的潜力之间的差距。

方案

本研究所述所有方法均经辛辛那提儿童医院医疗中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。

1. 初始位点准备

  1. 创建并测试热极化样品 129氙气体模（Xe gas phantom）图3).
    1. 获取一个耐压达150 psig的硼硅酸盐玻璃容器（约60 mL）、一个带有前端密封O型圈的柱塞阀以及一段磨口硼硅酸盐玻璃管茎。确保所有部件均不含磁性材料。将压紧接头连接至玻璃管茎上，并拧紧以形成气密密封。
    2. 将容器按照以下方式连接至真空泵和氧气储气罐 图 3A将真空室抽真空至绝对压力低于100 mTorr。
    3. 将容器充入氧气至1.5 atm压力以减少 129Xe T1 从 > 30 分钟至约 2 秒（在 7 T 磁场强度下；对于 9.4 T 扫描仪，使用 1.6 atm 氧气）。密封容器。
      注意：对于较高的场强，需要稍高的氧分压才能达到 T1≤ 2 秒84.
    4. 用400 mL同位素富集的氙气（85%）填充一个不透气的储气罐 129Xe
      注意：天然丰度的氙气（26% 129也可以使用 Xe，但需要增加信号平均次数，以弥补信噪比约 3 倍的降低。
    5. 将容器连接至储液罐 129Xe. 将真空管路抽真空至绝对压力低于 100 mTorr。
    6. 填充敞口、台式液氮罐2 Dewar 冷却至约 90%。将容器底部（约 5 cm）浸入液氮中以冷凝 O2 并创建真空（图3B。浸没时，打开阀门以允许 129来自储液器的 Xe 流入容器（图3C).
    7. 缓慢拉动阀杆，使柱塞中的进液孔移过O形圈，从而关闭柱塞阀。进液孔一旦通过O形9圈，立即用手拧紧以密封容器。将容器从液氮中取出，使其自然解冻。
      注意：解冻后，容器内压力将升至约 4.5 atm（2 atm O₂）2 + 2.5 atm 129Xe
    8. 保护玻璃器皿（例如，将容器插入带有衬垫的聚氯乙烯（PVC）管中）， 图3D).
      注：如果维护得当，该模型可维持压力长达十年或更久。
    9. 测量 T1 使用谱学反转恢复序列等方法确认模体的T1 < 2 秒，适用于 7 T 扫描仪。追踪信号和 T1 随着时间的推移进行质量保证（QA）。

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图3：根据步骤 1.1 中详述的方案制备热极化129Xe气体体模。 可通过调节O2和129Xe的分压，定制T1值，从而在特定磁场强度下获得合适的129Xe T1时间和信号强度84。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 使用热极化气体模体进行质量保证表1 和 图 4).
    1. 放置 129磁体等中心处的Xe线圈并居中 129线圈内的Xe气体模体。在单次脉冲-采集序列中（"单次脉冲"），将工作频率设置为匹配近似 129假体中 Xe 气体的频率（在 7T 下约为 83.07 MHz）。
    2. 将采集频率和激发频率居中至 129Xe 的拉莫尔频率，并将该频率用于所有模型校准和质量控制 129Xe 扫描。参见 表1 用于所有质量保证扫描的实验参数。使用模体定位器确认模体已居中图 4A).
    3. 进行摆动实验以校准翻转角：假设信噪比足够，使用重复时间（TR）间隔的单射频脉冲 > 5 × T1每次采集时，逐步增加射频功率，直至信号归零并开始反转。此处使用标准为：脉冲数 = 65；TR = 10 s；脉冲持续时间 = 125 µs射频功率 = 1–13.8 W，以 0.2 W 为增量逐步增加
    4. 傅里叶变换并校正第一组谱图的相位（即以最低射频功率获得的谱图）。对所有谱图应用相同的相位校正。将实部谱图相对于射频脉冲功率作图图4B).
    5. 产生零峰（即峰高最低）的功率对应于 180° 翻转角。实现90度翻转角˚ 通过使用产生180所需脉冲时长一半的脉冲，在相同功率下调整翻转角˚ 翻转角。假设扫描仪软件允许，设置此参数 90° 参考功率和脉冲长度，用于后续翻转角的缩放。
    6. 使用单次脉冲，通过最小化半高全宽来调节磁场匀场 129氙谱（TR ~ 1 s）。必要时，匀场后重新调整频率中心位置。记录半高全宽。
    7. 运行 129Xe QA 扫描（表1 和 图4C记录质量保证数据：信噪比（SNR）、模体平均信号和噪声的标准差。

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图 4扫描前质量保证。 (A低分辨率二维GRE冠状位模体定位像可确保模体位于磁体中心。B) 设置90°脉冲的章动实验˚ 脉冲在零峰处显示一个峰值 180° 脉冲。C) 在完成翻转角的定位与校准后，获取更高分辨率的二维梯度回波质量评估（GRE QA）图像。 请点击此处查看该图的放大版本。

实验方案简称序列描述TR (ms)TE (ms)平均次数 / 重复次数翻转角 (˚)矩阵大小或 Npts视野 (FOV, mm2)射频带宽 (RF BW, kHz)层厚 / 块厚 (mm)扫描时长
单脉冲脉冲采集10001 / 1602048101 s
模体定位序列2D GRE2003.720 / 14860 × 32120 × 483602 min
翻转角校准脉冲采集70001 / 652020485.127.5 min
129Xe QA 2D GRE50003.38 / 19032232234021 min

表1：模体校准质量保证序列参数。TR = 重复时间，TE = 回波时间，Npts = 采样点数，FOV = 视野，BW = 带宽。请点击此处下载该表格。

  1. 平面极化（图5A，B）。
    1. 选择极化的129Xe体积和积累时间：本方案推荐400 mL气体在15分钟内完成极化（图5），但可根据其他应用和设备条件灵活调整。
    2. 假设已知超极化装置内的死体积（例如，Vdead vol = 80 mL），计算输送体积Vdesired、129Xe气体比例f和积累时间tacc下的流速（FXe，单位为SLM）：
      figure-protocol-3     (1)
      注：虽然更长的极化时间通常可获得更高的极化度，但对于in vivo成像可能并不实用。应采用适用于所用超极化装置的适当模型85,86,87,88，以确定在极化时间和极化度之间取得平衡的流速。本文采用J. W. Plummer 等人的模型89（图5A）。该模型适用于连续流动型极化器，不适用于停止流动型超极化器90。
    3. 按照上述参数对气体进行极化，使用商用或自制设备测量极化度，并与预测值进行比较以进行质量控制（QA）。
    4. 测量运输过程中的极化度损失。若极化度下降显著（例如，>10%），应制作磁屏蔽运输箱以在运输过程中保护极化度。参见补充文件1：运输过程中的极化度管理，以及补充图1。

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图5: 偏振管理 (A) 极化度和产气体积是积累时间和流速的函数。使用400 mL的气体袋可在20分钟内提供较高的初始极化度（约35%）。虽然使用1 L气体看似更具吸引力，但其初始极化度较低（约20%）。B) 通风约15分钟后，取1升HP批次 129Xe 会耗尽至 <剩余600 mL气体时，偏振度为10%116因此，使用多个400 mL的袋子 129Xe保持更高的平均输送极化度。 C) 主磁场与有源屏蔽磁场相交的位置（位于 (N,N,N) 处的红色框）可能导致超极化（HP）的快速弛豫 129Xe. 表征磁体的边缘磁场有助于确定超极化 129Xe 可以放置而不发生快速弛豫（位于 (0,0,n) 位置的绿色框）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

补充文件1：运输过程中的偏振管理。 请点击此处下载该文件。

  1. 测量位置相关的 T1 的 HP 129Xe 在边缘场内（图 5C).
    1. 在 X、Y 和 Z 三个维度上，相对于磁体等中心创建具有已知距离和位置的参考点。标记等中心，并将其他位置依次标记为 n 至 N。待检测的位置数量将取决于可用空间。
    2. 使一小部分体积超极化 129氙气（约250 mL），并将其运送至MRI控制室。用一支大容量注射器（50–100 mL）抽取 129Xe 并将其置于磁体内的等中心位置（位置1） 图 5C）。展开约1˚ 翻转角脉冲用于测量信号。
    3. 将注射器保持在原位约10分钟，然后采集另一张谱图。每10分钟重新测量一次信号，直至信号衰减至少1 T1 （即信号已衰减至初始值的约三分之一）。
    4. 开始一个新的 T1 使用一支新的注射器进行实验 129通过重复步骤 Xe 1.4.2.
    5. 将注射器移至新位置（例如，位置 n） 图 5C）并停留10分钟。将注射器返回等中心点，以采集额外的约1˚ 翻转角谱
    6. 重复此过程：将注射器移至位置 n，等待 10 分钟，放回等中心点，重新测量信号，直至信号衰减至少 1 T1.
    7. 重复步骤 1.4.4 - 1.4.6 用于覆盖 X、Y 和 Z 方向的其余参考位置。
    8. 初始信号（S0) 将呈单指数衰减 n 射频脉冲，其具有 θ 翻转角。拟合信号（S) 随时间的变化函数（t在边缘场中计算 T1 每个位置：
      figure-protocol-5     (2)
    9. 确定一个具有足够 T 的位置1 (>20 分钟）用于 129氙储存器的放置。
  2. 制备无金属插管导管（图6).
    1. 取两根带鲁尔接头的静脉留置聚四氟乙烯（PTFE）导管。将针头丢弃至锐器处置容器中。
      ​注意：适用于小鼠 >25 g的动物使用18 G和20 G导管；较小动物使用20 G和22 G导管。
    2. 将鲁尔接头从导管上剪下。将较细的导管插入较粗导管的上端，以形成更尖细且更长的套管。将组合套管切成约4.6 cm长，末端呈斜面。 不包括鲁尔接头基部（图6A，B).
    3. 切下较宽的一端 200 µL 移液器吸头剪至约2.6 cm长度（图6C).
    4. 用通用脱模润滑剂涂抹移液器吸头内壁。将另一移液器吸头插入其中，均匀薄层分布润滑剂。用乙酸基硅酮硫化膏环氧树脂填充移液器吸头（图6D，E).
    5. 用一根两端均伸出的22 G金属丝堵塞套管。 将套管管穿过移液器吸头中的硅胶。使管子延伸至移液器吸头末端外约7 mm处（图 6F，G).
    6. 将套管管插入移液器吸头较宽的一端，穿过塑料公头滑入式鲁尔接头，并用环氧树脂将各部件粘合固定。剪去延伸超出鲁尔接头的管路部分图6H).
    7. 等待环氧树脂干燥（>24 小时），然后小心地将硅胶插管导管从移液管尖模具中取出。将导丝从导管中移除，确保导管未被堵塞（图6I).
    8. 为了便于插管操作，可连接一段导管（1/16）作为手柄" 或 1/8"）连接至一个雌性鲁尔接头。准备插管时，将该雌性鲁尔接头与雄性鲁尔插管导管相连。插管完成后，此部件可轻松拆卸（图6J).
    9. 每次在动物身上使用前进行消毒：用70%酒精擦拭套管外部；用消毒剂擦拭20 G导丝，然后将导丝穿过套管，以消毒内部并确保无堵塞。

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图6： 制备适用于小鼠插管的磁共振成像和超极化129Xe兼容套管。 如步骤 1.5所述，这些套管由静脉导管、移液器吸头和硅胶密封剂构成。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 每日数据采集

注意：参见补充文件2：临床前扫描质量控制检查清单。

补充文件2：临床前扫描质量控制检查清单。 请点击此处下载该文件。

  1. 完成每日扫描仪质量控制并设置呼吸机（图4）。
    1. 使用模体在扫描仪上运行QA协议（QA扫描参数见表1，每日质量控制步骤见第 1.2步）。
    2. 根据J. Nouls等人的方法校准呼吸机38。参见补充文件3：呼吸机校准、补充图2和补充图3。
    3. 设置呼吸机参数以进行吸气末成像（表2）。将动物床放置在扫描仪支架上，并将生命支持模块（即机械呼吸机部件）放置在扫描仪旁边的桌面上。
    4. 启动特定场所的动物加热系统。将加热器设置为35.5 - 40 °C，打开循环气流，并将气管置于动物头部位置上方约5英寸处，以预热扫描仪孔道。
通气设置HP 129Xe MRI 的推荐设置备注
潮气量（TV）8–10 mL/kg 理想体重中等潮气量；低潮气量需要更高的呼吸频率，可能导致图像中出现运动伪影
呼气末正压（PEEP）2–6 cmH2O
呼吸频率（BR）80–120 br/min
肺复张操作（RMs）每5分钟一次，35 cmH2O持续6秒
通气持续时间；体位＜6 h；仰卧位仰卧位以便更好地观察胸部运动
吸入氧浓度（FIO2）0.3–0.5防止麻醉小鼠发生缺氧
吸气时间与呼气时间比（I:E）1:2–1:4
吸气时间与总呼吸周期时间之比0.2–0.4
每分钟通气量≥0.57 mL·g-1·min-1
我们的标准：
BR = 80 br/min，吸气持续时间 = 200 ms，FIO2 = 0.3
吸气末成像：屏气 = 200 ms，触发延迟 = 吸气开始后200 ms
屏气期间成像：屏气 = 250 ms，触发延迟 = 吸气开始后250 ms
呼气末成像：屏气 = 200 ms，触发延迟 = 吸气开始后650 ms

表2：用于129Xe成像的推荐呼吸机设置。 参数可根据具体研究目标和实验条件进行微调117,118,119,120,121,122,123,124。请点击此处下载该表格。

补充文件 3：呼吸机校准。 请点击此处下载该文件。

  1. 镇静并为动物插管。
    1. 打开培养箱 27.7 °C 和/或电加热垫 37.7 °C. 测量并记录动物的体质量。根据体质量计算镇静剂给药剂量。参见 表3 典型的给药方案。
    2. 腹腔注射镇静剂。记录给药时间，并设定下次镇静剂给药的计时器。
      注意：在第节中完成剩余步骤 2（每日数据采集）应尽快完成，以尽量减少动物在镇静状态下的时间及过量用药的风险。
    3. 涂抹眼用润滑剂至眼部 动物的眼睛，并将动物放入垫有加热垫或置于孵育箱中的笼内，以防止低体温。
    4. 注射镇静剂后10-15分钟，通过脚趾夹捏试验确认动物是否完全镇静68. 按照 Das 等人所述的程序进行插管69.
      注意：Das 等人的文章69 并附有该技术的完整视频演示。步骤如下：
    5. 将动物仰卧位悬挂在倾斜板上，使其牙齿钩住板缘。使用啮齿类动物压舌板将舌头拉出。
    6. 为确保声带可见，可通过气管插管套管内的光纤电缆或置于咽喉外部的强光源提供白光。将套管插入至超过声带处不超过5 mm的位置。
    7. 通过将套管连接至一段内部带有微小水滴的导管，观察水滴是否随动物呼吸同步移动，以确认套管位于气管而非食管内。若水滴随呼吸节律移动，则表明位置正确。

药物剂量给药途径持续时间备注
吸入性药物
异氟烷诱导：4%–5%
维持：1%–
3% 或根据效应调整		吸入持续气流期间• 需使用校准过的挥发器
注射用药物
推荐方案：氯胺酮 + 赛拉嗪 + 乙酰丙嗪90 + 9 + 3 mg/kg腹腔注射20–60 分钟• 可导致体温过低风险增加
• 若需重复给药，建议改用氯胺酮 + 赛拉嗪混合方案，以防过量
• 药效消退时可能出现震颤。进行成像实验时，须严格遵守给药时间表
• 可能引起心动过缓
氯胺酮 + 赛拉嗪90 + 9 mg/kg腹腔注射20–40 分钟• 参见上述（氯胺酮 + 赛拉嗪 + 乙酰丙嗪）
戊巴比妥50 - 70 mg/kg腹腔注射20–60 分钟• 抑制呼吸频率和运动
• 药品成本可能过高
• 可能无法获得药用级产品
免责声明：以上仅为一般性指导原则。实施前请咨询兽医以获取更多信息。

表3：小鼠常用麻醉剂处方表。 请点击此处下载该表格。

  1. 通风动物（表2).
    1. 通过气管插管导管上的鲁尔接头将动物连接至呼吸机。监测膈肌运动及吸气峰压（约10–12 cm H₂O）。2若压力或呼吸运动异常，需根据需要仔细调整颈部角度和套管插入深度（例如，对于体重为10 mL/kg的潮气量）。
    2. 通过实施肺复张操作确保插管导管的气密性：阻止呼气（例如，用手指阻塞呼气端口），使动物在不呼气的情况下多次吸气。
      注意：若气道压力达到 35 cmH₂O2在约6秒的吸气峰压期间，气道密封应足够紧密。若未达到，参见讨论部分的故障排除建议。
    3. 恢复自然呼气。在扫描间期以及不进行扫描时每约5分钟实施一次肺复张操作，以维持肺顺应性并预防肺不张。将呼气末正压（PEEP）阀连接至呼气管路。将PEEP设定为4 cmH₂O。2O. 观察峰吸气压升高该数值。
    4. 成功插管后，规划并启动超极化（HP）物质的制备 129在扫描过程中，根据镇静剂补充给药时间表给予 Xe，以防止动物苏醒。整个实验过程中持续监测体温。
  2. 数据采集：采集通气图像。
    注意：数据采集步骤 2.4、2.5 和 2.6 可按任意顺序进行
    1. 根据以下参数设置呼吸机 表2 用于在呼气末成像。
    2. 加载以下设置程序：质子动物定位序列、单脉冲法用于在小鼠肺部气体频率处进行中心定位，以及 129Xe 动物定位器。参见 表4 用于扫描参数。
    3. 将动物置于等中心位置，并通过质子定位确认胸腔位于视野中心。若使用单频线圈，则将质子线圈更换为 129氙调谐射频线圈
    4. 记录 129Xe 极化并将其转运至 MRI 扫描仪。参见 补充文件 4氙气极化质量控制检查清单
    5. 放置一个袋子 129将装有 Xe 的呼吸机罐体连接并密封。将罐体与呼吸机串联，使罐体加压至 3 - 6 psig。
    6. 启动 129Xe 机械通气。每次 129启动氙气通气后，让动物完成约5次呼吸，以置换肺部的功能残气量，然后再开始扫描。
      注意：切换至 N2/2 混合物之间 129使用 Xe 扫描以保存超极化气体。
    7. 使用单次脉冲，调节工作频率以匹配 体内 气态共振频率 129Xe（7 T 下约 83.07 MHz）。将该频率复制到所有后续气相 129Xe 扫描。执行 129通过氙气定位确认肺部位于等中心。
    8. 加载并运行 129氙气径向通气序列。监测吸气峰压。
      注意：如果 129Xe 气体在方案完成前耗尽时，峰值吸气压将迅速下降。一个 400 mL 的袋子 129氙气可为一只30 g的小鼠通气约24分钟 以70%通气 129Xe 80次/分钟，潮气量为理想体重10 mL/kg。
    9. 扫描结束后，切换为使用 N 进行通气2/2 混合物并移除空袋 129Xe
    10. 在呼气末成像时，根据情况调整屏气持续时间和触发延迟 表2 并重复步骤 2.4.2 - 2.4.9。
    11. 从扫描仪导出原始数据。
实验方案简称序列描述触发方式TR (ms)TE (ms)重复次数翻转角 (˚) 矩阵大小或  Npts视野 (mm2)射频带宽 (kHz)层厚/ slab厚度 (mm)扫描时长
单脉冲脉冲采集（气相）可选10001602048101 s
动物定位扫描二维梯度回波（2D GRE）是501.716064232232560 s
径向通气成像三维多回波径向成像是20见图注13061322332.053016 分钟
溶解相单脉冲脉冲采集（溶解相）否8019051210.3580 ms
溶解相动态谱脉冲采集（溶解相）否5010009051210.550 s
扩散加权成像二维梯度回波（2D GRE）是12.28.144564232231.518 分钟


表4：体内序列参数。 此前描述的三维多回波径向通气序列39在6个回波时间点采集图像。结果显示的是第一个回波图像（TE = 1.12 ms，图7）。请点击此处下载该表格。

补充文件 4：氙气极化质量控制检查清单。 请点击此处下载该文件。

  1. 数据采集：运行动态溶解相光谱。
    1. 根据表2设置呼吸机，用于屏气期间的成像。将呼吸频率（BR）设为100次/分钟。按照步骤 2.4.2 – 2.4.5准备新的129Xe气袋。
    2. 启动129Xe机械通气。加载并运行单个脉冲，调节工作频率以匹配溶解相频率（在7 T下约为83.084 MHz）。将工作频率复制到溶解相动态光谱中。
      注意：在血红蛋白野生型小鼠中，这将呈现为单一峰54。
    3. 加载并运行以动物肺部溶解相频率为中心的动态光谱序列。 扫描完成后，切换为使用N2/O2混合气体进行通气，并移除空的129Xe气袋。从扫描仪导出原始数据。
  2. 数据采集：采集扩散加权图像。
    1. 根据表2设置呼吸机，用于屏气期间的成像。按照步骤 2.4.2 – 2.4.7准备新的129Xe气袋。
    2. 加载并运行扩散加权序列。扫描完成后，切换为使用N2/O2混合气体进行通气，并移除空的129Xe气袋。从扫描仪导出原始数据。

3. 结束实验

  1. 恢复动物状态。
    1. 将插管导管直接从动物口腔中拔出。如果动物未立即开始自主呼吸，请实施轻柔的胸部按压。如有条件，可在动物面部附近提供低流量医用氧气，以促进麻醉恢复。
    2. 一旦动物能够自主平稳呼吸，并且如果该动物此前接受了镇静处理，则 >2 h，皮下注射0.5–1 mL生理盐水以防止脱水。
    3. 将动物单独放回笼中。将笼子置于培养箱或加热垫上。
      注意：麻醉后的动物易受到同类相食的威胁，在完全恢复（即能够自主行走）之前，不得与同笼动物共同饲养。麻醉后的动物无法自主调节体温，应每隔几分钟用手背触摸动物以感知其体温。
    4. 密切观察动物，直至其翻正反射恢复（即能够自主从仰卧位翻转至俯卧位）。
    5. 动物能够自主行走后，将其移出热源支持。将动物放回笼中，与同笼伙伴一起饲养。
      注意：若动物无同笼伙伴，则更易发生麻醉诱导的低体温。应为动物提供额外垫料，如有条件，可将动物留置于培养箱中过夜。
    6. 每周记录动物体重一次，持续2周，以监测其健康状况。
      ​注意：如果动物因插管导致口腔或食道受伤，可能会停止进食。如果动物出现体重减轻 >体重减轻达到初始体重的20%时，应咨询兽医是否实施安乐死。
  2. 分析通气图像（图7).
    1. 将原始数据载入编程平台。下载用于非笛卡尔成像的开源重建框架91.
    2. 根据开源框架的说明重建图像。对每条径向投影上的第一个点进行归一化处理39.
    3. 在图像中对肺实质进行分割，包括低密度或无密度的体素 129Xe信号。不要包含大气道。对图像中的背景噪声进行分割，排除肺部、气道和成像伪影。
      注：质子定位图像有助于确定实质边界。
    4. 计算 SNR 使用公式：
      figure-protocol-7     (3)
    5. 量化缺陷通气。
      注意：已有多种方法被提出用于量化小型动物模型中的通气功能障碍。分析方法仍是待深入研究的领域，但易于实施的方法包括：（i）半定量手动分割92，(ii) 使用气管信号对肺实质信号进行归一化的直方图方法47，以及（iii）分割全肺容积（阈值限值）并定义信号阈值（例如， <60% 的全肺平均值）将肺部分为缺陷体积和通气肺体积（VV）。定量 VDP93,94 根据：
      figure-protocol-8     (4)
  3. 分析溶解相动态光谱学（图8).
    1. 将原始数据导入编程平台。进行快速傅里叶变换，并对谱图进行相位校正（本应用中，可采用手动同步的零级相位校正）。
    2. 计算标准核磁共振（NMR）数据95,96信噪比、半高全宽、积分面积、化学位移以及两个峰的相位。
    3. 根据幅值数据，将每个重复时间点的溶解态谱图信号幅值除以气态谱图的信号幅值，以得到随时间变化的溶解态与气态比值。
  4. 分析弥散加权成像（DWI）图像图9).
    1. 将原始数据导入编程平台。分割 b 的肺实质0 步骤中的图像 3.2.3. 计算每个 b 值图像的信噪比（SNR）。
    2. 计算信号值与噪声比（SVNR）0, 通过将每个体素中的信号除以 b0 通过图像噪声的标准偏差对图像进行归一化。排除SVNR的体素0 < 2.5 倍图像噪声97.
      注意：SVNR0 是单个体素的指标，而肺实质信噪比是全肺范围的指标。
    3. 计算 ADC 通过拟合信号在不同b值下的衰减bi) 根据公式 598,99:
      figure-protocol-9     (5)

结果

通气图像

如果动物准备和通气操作实施得当，在吸气或呼气阶段进行数据采集时，三维径向成像能够成功捕捉到通气模式（图7）。尽管这些图像是在多次呼吸过程中采集的，但此处描述的方法类似于在人体中使用的单次呼吸成像方法。其原因是所有k空间的采样线均在呼吸周期的特定时刻采集（例如，全部在吸气末采集），从而累积形成一幅代表单次吸入状态的图像。在这些图像中，主要气道（气管和支气管）清晰可见，无明显图像伪影，肺实质呈现充分膨胀状态，且信噪比较高（约15或更高，取决于初始极化水平）。尽管看似违反直觉，但在吸气时采集的图像（图7A， 信噪比 = 15）的信噪比低于在呼气时采集的图像（图7B，信噪比 = 27）。这与对小鼠通气时所采用的较低驱动压力和缓慢气流有关。在吸气图像中，超极化气体尚未完全灌注至肺实质，导致129Xe（从而信号）集中在较大的气道中。在图像重建过程中，由于k空间缩放处理进一步放大了这种效应，高气道信号主导了数据的动态范围，使该现象在视觉上更加明显。然而，只要对肺实质进行分割以排除大尺寸气道，后续分析仍应较为简便。

figure-results-1
图7： 使用先前发表的方法获得的成年C57BL/6J小鼠代表性三维径向通气图像39。尽管两幅图像均具有相对较高的信噪比，但（A）吸气相图像的信噪比较（B）呼气相图像更低，主要原因是129Xe气体尚未充分进入肺部。 请点击此处查看该图的放大版本。

必须区分病理性通气阻塞与其他导致信噪比（SNR）降低的原因。图7A中未预期出现通气阻塞（即通气缺陷百分比VDP较低），因为该动物为健康的野生型小鼠。若存在通气阻塞，缺陷通常表现为129Xe信号从低到无的区域。信号降低的非病理学原因通常包括：

(i)  低 129Xe 极化: 这会导致肺实质和气道中的信噪比降低，且不伴随伪影。低极化通常可归因于极化过程操作不当、运输过程中去极化，或过量的O2 HP中的气体含量 129氙气输送管路（例如，来自校准错误的呼吸机）。

(ii)  插管导管插入过深：若导管插入气管过深，可能偏转进入左或右支气管。若嵌顿较紧，整个肺的潮气量可能仅局限于少数肺叶和气道，而其余肺组织则无法通气。一旦发生这种情况，过度膨胀的肺叶可能受损，甚至需要对动物实施安乐死。此外，导管尖端可能直接接触组织。此时，129Xe 主要局限于导管内部，成像表现为一条明显笔直的高信号管状结构，而肺实质内的信号极弱。此时应立即调整导管位置，并密切监测动物是否出现痛苦迹象（例如，胸壁运动异常、缺失或与呼吸机不同步）。

(iii)  气管插管导管置入过浅：当气体团注被输送至口咽部过浅的位置时，气体进入肺部所遇到的阻力可能大于其从导管外部绕行并从口腔排出的阻力。这可能导致肺部膨胀不良。此时气管信噪比（SNR）可能较高，而肺实质信噪比则较低。由于在数据采集期间气体沿气管上行，可能出现运动伪影。伪影的特征会因序列类型（如GRE、径向序列等）不同而有所变化。

(iv)  采集时序错误：若射频脉冲激发与数据采集发生在吸气或呼气气流期间，通常会出现严重的运动伪影——尤其是在使用笛卡尔序列时——且实质组织的信噪比（SNR）会较低。

（v）  自主呼吸：如果在数据采集过程中动物镇静不足，自主呼吸运动将异步叠加于机械通气模式之上。这将导致每次呼吸间129Xe的递送不均、出现中度至重度的运动伪影，以及肺实质信噪比（SNR）降低。因此，必须仔细监测镇静剂的剂量和给药时机。

（vi）  动物死亡: 在极少数情况下，小鼠可能会死亡（例如，由于套管位置不正确、O2 给药、镇静剂过量或严重实验性病理）。若发生此类情况，肺组织会迅速变硬，肺实质将 膨胀不良。上段气管可能信号较强，但肺实质信号会非常低。

气体交换光谱法

在人体受试者中，光谱学衍生参数（如信号强度、谱宽、化学位移和相位）可提供关于心肺动态及疾病状态的信息52,53. 与人类不同86，狗100和大鼠20,101小鼠全肺光谱获取时 129Xe磁化被限制在肺实质中，显示出单一的宽溶解相共振峰，对应于 129Xe 溶解于毛细血管膜组织、血浆和红细胞中54 (图 8A, 197 ppm）。当通过血流输送到更远端的组织时， 129Xe 会产生来自包括脂肪组织在内的各种组织的独特共振频率54肌肉、灰质和白质102,103然而，由于相对较长的传输时间（数秒）和有限的溶解度104 （Ostwald 溶解度 = 0.1 - 0.3），这些信号通常较弱，仅在专门且仔细的实验中才能观察到。例外情况是 129Xe 溶解于脂肪组织中（图8A，189 ppm）。从这些组织中，一种 129Xe信号可在数秒内出现（例如，在动物准备期间的最初几次呼吸中）。此外，由于Ostwald溶解度的影响，信号强度可能较高。 129Xe 在脂肪组织中的浓度约为血液血浆中的 20 倍（即在 37℃ 时分别为 1.7 和 0.094） ˚C104）。纵向弛豫时间也预计相对较长（体内 T1 在脂质中约为 20 s105 vs. 血液中的3-8秒106）。因此， 129与其它组织相比，脂肪组织中的 Xe 信号可能相对较高。

由于信号动力学的差异，通过选择合适的采集参数，可以针对脂肪组织（例如，靶向棕色脂肪组织测温107）或肺部气体摄取来定制129Xe波谱实验。当采用表4中所述参数（即，TR = 50 ms，90˚翻转角中心位于溶解相峰）采集小鼠肺部的129Xe谱时，可同时观察到气相和溶解相的峰信号（图8A、B）。值得注意的是，小鼠肺部的气体体积是组织体积的2-3倍，而129Xe在该组织中的溶解度仅为约10%104,108,109,110,111。尽管如此，溶解相信号的幅度仍约为气相信号的2倍，原因是气相激发严重偏离共振频率（在7 T下约为15 kHz；图8B，信噪比分别为102和43）。因此，在呼吸周期的静态阶段，气相中大20至30倍的磁化池可近似视为溶解相信号的稳定（即，未被耗尽的）储备源。

大约每600毫秒进行一次新的磁化激发，重复时间（TR）为50毫秒，此时129Xe的气相和溶解相信号强度均呈现振荡。气相信号的变化归因于总气体体积的改变（即吸气时信号高，呼气时信号低）。溶解相信号的情况更为复杂，因为其信号来源受到源气体磁化强度、T2* 以及毛细血管血容量随肺部充气状态波动的影响。因此，溶解相与气相信号的振幅比也随呼吸周期发生振荡（图8C，平均溶解相:气相信号比为1.9 ± 0.39）。

figure-results-2
图8: 代表性动态光谱学在 成年C57BL/6J小鼠 (A单次脉冲光谱显示信号来源于 129气相中的Xe、溶解于脂肪组织中的Xe（189 ppm）以及溶解于毛细血管膜和血液组织中的Xe（197 ppm）。(B) 动态光谱显示溶解态和气态物质随时间变化的信号强度 129Xe（重复时间为 50 ms）。为便于可视化，仅显示五个谱图。时间轴上的对角线表示量程间断。C在2秒时间间隔内（对应于B图中的红色标度断点），溶解相与气体相信号振幅的比值随呼吸周期（每呼吸一次0.6秒）呈现明显变化。 请点击此处以查看此图的放大版本。

以下列出了可能影响129Xe气体交换光谱结果的若干因素。在每种情况下，其可能结果均为信噪比（SNR）偏低，从而导致光谱拟合及相应指标（如溶解相与气相信号强度比、化学位移、谱宽和相位）不准确。

(i)  错误的工作频率：由于气相体积显著较大且组织溶解度低，以气相频率为中心的射频脉冲将不会产生溶解相信号。射频脉冲应以溶解相频率或其附近频率为中心。

(ii)  带宽过宽：激发带宽应足够宽，以确保部分气相129Xe被激发，从而测量溶解相与气相信号振幅的比值。但如果带宽过宽，激发脉冲将在气体溶解进入组织前破坏其气相磁化。这种现象表现为气相信号非常强，而溶解相信号很低甚至缺失，尽管脉冲中心频率位于溶解相频率处。

(iii)  未优化的重复时间（TR）：为了在一次呼吸周期内探测信号动态，根据奈奎斯特-香农采样定理，信号的采样频率至少需为其频率的两倍（此处为每分钟100次呼吸，每50 ms采样一次，约每呼吸周期采样12次）。根据实验条件，可通过更高的采样速率进一步探测 cardiopulmonary 信号动态。这些实验的结果将取决于多种因素，包括激发带宽、呼吸频率和心率。还需考虑氙气交换时间（即氙气溶解进入组织所需时间，约56 ms54）和肺循环通过时间（即血液从右心室流至左心室所需时间，当心率约为436次/分钟时，约为830 ms112）。采样过频繁会导致磁化信号过早被破坏而信号降低，但同时也会减弱血流影响；采样频率较低则允许磁化信号进一步积累并增强信号强度，但会使其更依赖于血流，且在肺泡气体交换区域的定位性更差。

弥散加权成像

用于量化肺泡气腔大小的扩散加权成像已在小型动物模型中通过传统的组织形态计量学方法得到严格验证98,113,114此处，我们仅限于二维、层面选择性成像的讨论，以尽量减少扫描时间 时间和气体消耗，同时符合先前已验证的实验方案98至少需要2个b值图像才能计算表观扩散系数（ADC），而进行高级形态计量学计算（如平均线性截距）则需要4个或更多的b值图像。采集多个b值图像具有显著优势，可提高计算的准确性。与在单次屏气期间对人类进行成像不同，临床前成像可在多次呼吸过程中持续获得信号补充。因此，能够采集大量高信噪比（SNR）的b值图像，其数量仅受限于超极化气体的可用体积和动物镇静时间。本研究中采集了7个b值图像，每个图像均具有高信噪比（SNR） >15，使用400 mL的 129Xe 气体，扫描时间超过 18 分钟（图9）。每幅图像中的信号随扩散梯度强度（b值）增加而衰减。该信号衰减与表观扩散系数（ADC）成正比。 129肺内的Xe。通过比较b，可以区分大气道与肺泡组织。0 和 b6 图像。在解剖学上可能含有气道的区域，像素在 b 中会显得非常明亮0 图像中呈现为暗色6 图像（红色箭头， 图9）。这些像素应从肺实质的分析中排除。

figure-results-3
图9：成年C57BL/6J小鼠的代表性扩散加权图像。 大气道（红箭头所示）中，129Xe在氧气稀释下自由扩散，其信号衰减程度高于肺实质组织。这导致在b0图像中大气道呈现高信号，而在b6图像中则表现为低信号。小鼠和大鼠的表观扩散系数（ADC）值均较人类小，但具体数值会受年龄、潮气量、压力及扩散参数等生物学和实验因素的影响。请点击此处查看该图的放大版本。

该健康成年野生型小鼠的ADC结果根据文献报道，与其年龄、信噪比（SNR）、采集参数等因素相符，符合预期。可能对ADC结果的精确性和准确性产生不利影响的因素包括：

(i)  低信噪比: 重要的是，图像中较低的信噪比会使表观扩散系数（ADC）的计算结果偏向较低值99,115因此，我们排除SVNR过低的体素0 < 2.5 倍图像噪声97.

(ii)  分割不当： 分割效果不佳（例如仅使用信号阈值化而未通过视觉检查进行质量控制）可能导致结果偏差。如果图像中存在伪影（如由运动引起的伪影），这些区域可能超过阈值而被错误地归类为实质组织。此外，排除靠近大气道的像素尤为重要，因为部分容积效应可能使这些区域的表观扩散系数（ADC）偏向更高值。

(iii)  校准错误的呼吸机：通常情况下，用较轻的气体（例如 O2 或 N2）稀释 129Xe 会导致表观扩散系数（ADC）向更高值偏移，因此进行定量比较时必须使用已知混合比例的气体进行通气。若使用 129Xe/O2 混合气体通气，在气体输送前氧气浓度升高会延长 T1 弛豫时间，并降低气体输送管路中 129Xe 的磁化强度，从而降低信噪比（SNR）。

（iv）  肺泡去复张: 在麻醉并接受机械通气的动物中，肺泡可能随时间推移发生塌陷（肺不张）。当这种情况发生时 恒定容积通气时，相同的潮气量必然重新分布至仍保持开放的肺泡。随着中至重度肺不张的发展，其余肺组织可能出现过度膨胀，导致损伤并使这些区域的表观弥散系数（ADC）升高。规律实施肺复张手法并使用呼气末正压（PEEP），可防止肺泡塌陷，避免肺顺应性下降，并最大限度降低可能影响ADC结果的肺损伤风险。

(v)   数据拟合不佳：必须考虑ADC估计的方法。对数线性拟合计算效率最高，但在低信噪比（SNR）图像中会引入偏差，因此最适合用于高信噪比图像（>20）。加权线性法可减少这种偏差，适用于信噪比 > 15 的图像。贝叶斯估计即使在信噪比 < 10 的情况下也能获得不确定性较低的ADC估计值，但计算成本较高99。

(vi)  扩散时间不足: 最佳扩散时间受MRI扫描仪的最大梯度强度和小鼠腺泡气道半径的影响 （半径 ~100 µm49），约为人类的三分之一。为确保最佳条件，设定扩散时间以使扩散长度大于平均肺泡半径，但小于肺泡管的平均长度。可通过Sukstanskii和Yablonskiy提出的方法确定特定部位最大梯度强度下的最佳扩散时间。49. 采用非最佳的扩散时间可能导致非线性下降 129Xe ADC，使结果的解读变得复杂。

（vii）  b值次优：在最大化信噪比（SNR）与最大化不同b值图像间的对比度噪声比（CNR）之间存在权衡。 若仅使用较低的b值（即扩散信号衰减如同仅采集图9中的前3个b值图像），则会因拟合效果不佳而导致表观扩散系数（ADC）估计不准确。若扩散加权过强，则最终信噪比将不足，导致ADC偏向低估。

讨论

超极化129Xe MRI 正逐渐成为研究小动物模型肺部微结构与功能的一种先进而强大的技术。本方案旨在指导实验场所的初步准备，并描述利用超极化129Xe 定量评估小鼠肺部通气、扩散和气体交换所需的实验操作流程。实验的关键先决条件包括建立129Xe 气体模体，以及确保将高极化度的气体有效输送至动物体内。后者需要仔细规划极化参数，在气体运输过程中尽量减少极化损失（例如，构建磁屏蔽运输箱），并表征（并尽可能避免）在小动物 MRI 磁体边缘磁场中发生的 T1 弛豫116,125。在同步建设必要的超极化129Xe 技术平台的同时，必须建立可靠的动物操作规范与流程，包括有效的镇静以实现稳定的机械通气，无创性气管插管以支持纵向研究，以及在输送高129Xe 磁化气体与维持安全且符合生理状态的通气条件之间取得平衡的通气策略。

在一定程度上，本文所述的方法、操作流程和结果依赖于所使用的特定硬件（例如呼吸机、极化器和磁共振成像仪型号）。如果使用其他设备，实验技术可相对容易地进行调整。此外，每日的质量保证程序也可进一步优化（步骤 1.2、图4 和 表1）。在新建立实验平台时，约30分钟的质量保证过程中的细致记录至关重要，有助于及早发现硬件问题，并在故障排查时排除这些问题。一旦质量保证指标的日间变异特征已充分明确，翻转角校准和约21分钟的质量保证扫描可酌情缩减以提高效率。此外，通过调整麻醉剂量、呼吸机参数和采集参数，该通用方法也可拓展应用于其他常见小型动物物种（如大鼠和兔）。基本实验方案可用于研究依赖呼吸机的生理学问题，例如呼吸频率、潮气量和呼气末正压（PEEP）水平对气体交换或肺泡募集的影响。若无需纵向数据或纵向研究已完成，气管插管套管可便于进行支气管肺泡灌洗，或快速固定并取出肺组织以进行常规分析（如组织学或形态计量学测量）。此外，本方案在磁共振成像序列和参数方面的可修改性，体现了129Xe MRI研究的动态发展特性。

套管放置对动物安全和图像质量至关重要。由于气管插管套管并未通过刚性方式固定（例如，未在气管周围缝合固定），即使较小的位移（例如，连接生理监测设备时的移动）也可能破坏与气管之间的密闭密封。该密闭密封对于肺复张操作（约35 cm H₂O）和维持通气至关重要。2吸气峰压），这对于维持肺顺应性和防止肺不张至关重要。若复张操作未能达到目标压力，研究者需结合研究目标权衡纠正策略（例如，弥散加权成像与通气成像；单时间点与纵向研究）。可采取的应对措施包括：1）移除导管并重新插管，2）在导管仍插入状态下调整其位置，以增强与气管壁的贴合，3）在未实现气密密封的情况下继续实验。从数据保真度的角度来看，重新插管是最可靠的选项，但可能耗时较长并导致不必要的 129Xe磁化衰减。调整插管位置速度较快，但应谨慎操作，因其具有较高的损伤风险。若实验中不使用呼吸机（RMs），则最适合用于对小鼠进行通气的情况下继续实验 <20 分钟，以避免因肺不张引起的肺部动力学改变117.

除了安全动物操作的显而易见需求之外，建立稳健可靠的超极化 129Xe小鼠MRI项目——以及解决其挑战——的关键在于细致的记录保存。对于HP 129在Xe的制备过程中，建议追踪激光功率、积累时间、流速和极化度。在模体成像和波谱分析期间，最好记录图像信噪比、峰位、谱线宽度以及获得90°射频脉冲所需的射频功率。˚ 脉冲。对于 在体 成像时，应同时记录类似的质控数据和生理监测参数（峰吸气压、体温等）.）以及动物操作事件的详细时间表。一些关键设备可简化呼吸机的故障排查，包括一个 O2 传感器、小动物肺量计和压力计，用于校准通气和呼气末正压（PEEP）压力。示波器和电压表可辅助确认呼吸机时序的精确性，并与磁共振成像（MRI）扫描仪的门控同步。最后，手持式高斯计对于确认磁场强度至关重要 磁体的完整性 运输时如需使用携带箱，请妥善携带。关于MRI序列故障排查，建议同时使用本方案中描述的气体 phantom 以及一支装有HP气体的注射器。使用含有HP气体的注射器 129Xe气体在调试扩散加权序列时尤为有益，因为可根据数据是否反映已知的真实值——即纯Xe的自由扩散系数——来评估其准确性 129注射器内的 Xe。

应用本方案时必须认识到若干局限性。首先，该技术依赖于专业设备和专业知识，这限制了新机构的可及性。然而，随着美国近期批准其用于临床，具备129Xe MRI能力的机构数量预计将逐步增加。该技术还受到超极化气体本身固有特性的限制，包括相对较短的极化寿命以及需要快速采集数据。使用机械通气机通常可提高图像信噪比（SNR），并内在避免运动伪影，但会掩盖通过自由呼吸气体输送装置所能捕捉的自然呼吸动态。此外，鉴于物种间存在显著差异，将本方案在小型动物模型中获得的研究结果外推至人体生理时应谨慎解读。另一个局限性在于经口插管和机械通气操作本身具有挑战性，对于体重低于25 g的小鼠尤为困难。这可能排除约8周龄以下的雄性小鼠和约20周龄以下的雌性小鼠，除非使用专用设备和操作流程。本方案最显著的局限性是未包含脉冲序列编程和先进的图像重建技术。由于这些方法技术细节复杂且需要专业知识，难以将其纳入通用型方案中。最后，本方案仅描述了信噪比（SNR）、通气缺陷百分比（VDP）和表观扩散系数（ADC）等基本定量指标，未涵盖区域分数通气、扩散形态学分析及气体交换成像等更高级的测量方法。一旦本文所述的基本技术平台建立，这些高级指标将更容易实现。

尽管小动物超极化129Xe气体磁共振成像（MRI）资源消耗较大且实验难度较高，但它有望显著推动临床前肺部研究的发展。该技术提供了一种微创且灵敏的方法，可用于量化区域性通气、肺泡腔大小以及气体交换动力学。因此，它能够独特地用于评估肺部生理功能、疾病进展以及随时间变化的治疗干预效果。与传统的临床前技术（包括组织学、生化分析、电离辐射成像方式以及侵入性肺力学测量）相比，该方法具有明显优势。此外，小动物129Xe MRI仍是当前活跃发展的研究分支领域，将相关成像物理原理与临床前需求相平衡本身便代表着重要的研究机遇。最后，随着临床129Xe MRI在临床上被越来越广泛接受和应用，人鼠之间双向转化研究的机会也将持续增长。

补充图1：磁力携带箱的电路图。 由漆包铜线制成的螺线管线圈L1与一个12伏可充电密封铅酸电池V1并联连接。可通过选择电阻器R1的阻值来调节通过V1和L1的电流。面板指示灯LED灯R2 和D1也与V1并联连接。一个拨动开关S1与V1串联连接。请点击此处下载该文件。

补充图2：氮气的呼吸机校准结果。 对30次呼吸的输出体积进行了三次重复测量。通过线性回归分析确定产生相应气体体积所需的驱动压力。请点击此处下载该文件。

补充图3：呼吸机压力设置速查表 每种气体的线性回归所得斜率和截距用于公式 S1。该公式被用于 以确定产生相当于理想体重10 ml/kg潮气量所需的驱动压力，用于70% N₂的气体混合物2 + 30% O₂2 和 70% 129Xe + 30% O₂2 针对相关动物体重。 请点击此处下载此文件。

披露

Peter Niedbalski 是 Polarean Imaging, Plc 的顾问。

致谢

作者衷心感谢Jerry Dalke在呼吸机构建过程中提供的指导。感谢Carter McMaster制备超极化129Xe气体。同时感谢Matthew Willmering博士和Juan Parra-Robles博士富有启发性的科学讨论。插图使用BioRender.com制作。本研究由美国国立卫生研究院资助（项目编号：NHLBI R01HL143011，R01HL151588）

材料

本文使用的材料清单
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400 mL 特德拉袋（Tedlar 袋）Jensen Inert ProductsGST-001S-3507TJCNA
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超极化仪Polarean9820https://polarean.com/xenon-mri-platform/
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压力计Grainger3T294https://www.grainger.com/product/3T294?gucid=N:N:PS:
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肺量计 - 小鼠流量头ADInstrumentsMLT1Lhttps://www.adinstruments.com/products/respiratory-flow-heads
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氙气极化测量站PolareanNAhttps://polarean.com/xenon-mri-platform/

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