将干细胞来源的神经祖细胞移植至人脑皮层切片

从已准备向皮层神经元分化的干细胞来源的神经祖细胞贴壁培养物开始。

移去培养基，然后加入酶以破坏细胞外基质并使细胞脱落。

使用抑制剂中和酶，然后加入新鲜培养基。

将悬液转移至离心管中，离心后弃去上清液，以分离细胞。

将细胞重悬于基底膜基质中，以促进其移植至脑组织，然后将其加载到冰冷的毛细管中。

将人脑皮层切片置于含有培养基的Transwell小室中。

移除部分培养基，然后将细胞悬液滴注到组织中。

孵育以使基质凝固。

加入培养基以浸没组织，随后孵育，使前体细胞分化为神经元，延伸其神经突，并与宿主皮层神经元形成突触。

皮层切片现已准备好进行分析。

移除细胞培养瓶中的培养基。在分化第七天，加入 500 微升胰蛋白酶，室温孵育 5 至 10 分钟，使皮层诱导的 GFP-lt-NES 细胞脱离。

接着，加入等体积的胰蛋白酶抑制剂，然后加入5毫升DDM培养基。重悬细胞，轻柔地将细胞悬液转移至15毫升离心管中，在300 ×g条件下离心5分钟。同时，将含有人体组织的培养板从培养箱转移至生物安全柜中，并从插入物顶部移除2毫升培养基。离心结束后，弃去上清液，将细胞重悬于冰冷的纯基底膜基质中，并将悬液转移至较小的离心管中。

将细胞悬液收集到连接有橡胶吸头的冷玻璃毛细管中，通过刺入半干燥的组织切片多个位点，将细胞悬液以微小液滴形式注入。在37摄氏度下孵育30分钟，使凝胶完全凝固。

然后，将培养板从培养箱中取出并放回超净台，小心地向插入物顶部加入 2 毫升人成年皮质培养基，以完全浸没组织。