细菌外膜来源的胞外囊泡的分离与富集

首先将一株基因工程改造的细菌菌落接种到液体培养基中。

这些细菌在外膜（一种外部保护层）中表达一种荧光融合蛋白。

孵育细菌以释放细胞外囊泡（EVs），即参与细胞间通讯的膜结合纳米结构，其中包含荧光蛋白。

将培养物转移至离心管中，低速离心以沉淀细胞。

转移含有细胞外囊泡（EVs）、细胞蛋白和细胞碎片的上清液。高速离心后，弃去含有碎片的上清液。

通过膜过滤上清液，以去除任何残留的细菌和碎片。

在琼脂培养基上接种样品并进行培养。若无细菌菌落形成，则证实样品中无细菌存在。

将溶液转移至带有半透膜的超滤装置中，离心以截留细胞外囊泡（EVs），同时去除较小的蛋白质。

将浓缩的EVs收集到离心管中，用于后续分析。

首先，用无菌接种环将单个 Escherichia coli 菌落接种至 250 至 1000 毫升的 Luria-Bertani（LB）液体培养基中。然后，在 300 转/分钟、37 °C 条件下，将培养物于摇床培养箱中进行好氧培养。培养 48 小时后，将菌液转移至洁净的 500 毫升聚丙烯离心管中，于 4 °C、5,000 ×g 条件下，使用大容量固定角转子离心机离心 15 分钟，以澄清细菌培养液。

将上清液小心倾倒入干净的离心管中，于10,000 × g 离心15分钟。随后，将上清液转移至适当大小的0.2微米聚醚砜真空驱动滤器装置，并将过滤装置连接至真空壁式供气系统。若过滤速率显著下降，需将未过滤的样品转移至新的过滤装置中。

过滤后的培养基可在4°C下保存过夜，也可立即进行后续处理。为检测活细胞是否完全去除，取一份过滤后的上清液涂布于合适的琼脂平板上，在该细菌菌株最适培养条件下孵育后，确认无任何菌落生长。对于体积为100毫升的过滤培养基，将其90毫升加入截留分子量为100千道尔顿的离心超滤装置的储液室中，在4°C条件下，使用水平转子以2,000 × g离心15至30分钟为一个间隔，重复操作直至上层储液室中的培养基体积浓缩至小于0.5毫升。

将剩余的过滤培养基加入储液池以补充液量，并移除装置底部的流穿液以重新平衡。如果储液池中浓缩培养基的黏度明显增加，可用 PBS 稀释培养基，再通过离心重新浓缩，以去除分子量截断值低于 100 千道尔顿的非细胞外囊泡（EV）蛋白质。然后，将浓缩后的培养基转移至低蛋白结合管中，在 4 摄氏度下过夜保存。