细菌芽孢内膜中萌发蛋白的可视化

取一张载玻片，其上含有休眠的细菌芽孢和作为参照的荧光微球。

孢子携带红色和绿色荧光报告基因，用于标记萌发相关蛋白，同时使用亲脂性染料对内膜进行染色。

将玻片置于配备油浸物镜的结构照明显微镜（SIM）上。

定位荧光微球，并调节焦距以最小化图像模糊。

接下来，使用透射光定位细菌孢子。

切换至SIM模式，并照射孢子以激发荧光染料。

获取孢子深度范围内的高分辨率荧光图像。

在脂溶性染料染色的内膜上，萌发蛋白呈现为明显的红色和绿色焦点。这使得能够精确定位细菌芽孢内萌发蛋白的位置。

进行样品成像时，将载玻片置于配备100倍油镜的结构照明显微镜上，并聚焦于100纳米的荧光微球。

调节100倍物镜上的校正环，直至获得对称的点扩散函数，以最大限度减少图像模糊，并选择一个包含约10个圆形荧光微球的视野。针对指定的激发波长（本例中为561纳米和488纳米）进行光栅聚焦调整，作为在透射光下对孢子聚焦前的图像分析软件参考。以16倍平均模式采集透射光图像，每次曝光时间为20毫秒。

然后，使用三维结构光照明显微镜（3D-SIM）的成像模式，采集孢子的三维结构化照明原始荧光图像。