利用细菌粗提细胞提取物进行无细胞蛋白质表达

无细胞蛋白表达系统利用细菌的粗制细胞裂解液，其中含有体外转录和翻译所必需的分子机制。

该裂解液包含转录因子、核糖体和转运RNA（tRNA）。

向裂解液中加入含有DNA模板、RNA聚合酶、核苷酸和氨基酸的混合物。

将其转移至PCR板中，离心以收集附着在管壁上的液体。密封反应板以防止蒸发。

在热循环仪中于最佳温度下孵育，以支持无细胞蛋白表达。

转录因子与RNA聚合酶结合形成复合物，该复合物可结合到模板DNA上。

该复合物催化RNA合成，通过加入核苷酸生成信使RNA（mRNA）。

mRNA招募核糖体，启动翻译过程，期间tRNA将相应的氨基酸运送至核糖体，以形成多肽链。

多肽链折叠成具有功能的蛋白质，可用于后续实验应用。

进行无细胞蛋白表达时，将DNA模板、10倍能量溶液主混合物和4倍氨基酸主混合物分装在室温下解冻。然后从-20摄氏度冰箱中取出T7 RNA聚合酶和RNase抑制剂储备液，并置于冰上。待DNA模板、10倍能量溶液主混合物和4倍氨基酸主混合物完全解冻后，立即置于冰上。

在冰上将各组分按准确顺序加入一个2毫升离心管中，配制无细胞反应主混合液，每加入一种组分后轻轻弹击管壁混匀。从-80 °C冰箱中取出Vibrio natriegens粗细胞裂解液，置于冰上10至20分钟，直至完全解冻。向无细胞反应主混合液中加入适量体积的解冻粗细胞提取物，用移液器轻轻混匀。

使用PCR仪进行终点无细胞蛋白表达时，首先在96孔PCR板的每个孔底部加入10 µL无细胞反应主混合液，确保在每次向PCR板转移之间轻轻弹动试管以混匀主混合液。将板在1,000 × g离心10秒，使可能粘附在孔壁上的主混合液沉降至孔底。然后用板密封膜封住各孔，防止蒸发。

将反应板放入已预热至26摄氏度、热盖温度设为105摄氏度的PCR仪中。在PCR板中孵育反应至少三小时后，可对表达的蛋白质进行纯化、定量，并用于后续实验步骤。