荧光标记阻遏蛋白介导的复制阻断 大肠杆菌

取一种经过基因工程改造的大肠杆菌（E. coli）培养物，该菌株表达染色体上的四环素操纵子（tetO）阵列。

这些细菌还携带一种含有阿拉伯糖诱导型启动子的质粒，该启动子可驱动与黄色荧光蛋白（YFP）标记的四环素阻遏蛋白的表达。

将菌种转移至含有抗生素的富集型营养培养基中，振荡培养以筛选含质粒的细胞。

随着细胞生长，复制体形成并启动染色体DNA复制。

在指数生长期，收集一部分作为未诱导对照。

向剩余的培养物中加入诱导剂阿拉伯糖，并将两份培养物置于摇床中孵育。

在未诱导的培养物中，AraC 二聚体仍结合于 DNA 环上，抑制阻遏蛋白的表达。

在诱导培养中，阿拉伯糖与AraC二聚体结合，诱导阻遏蛋白的表达。

阻遏蛋白结合到染色体上的 tetO 阵列，阻止复制叉的前进。

使用荧光显微镜观察两种培养物。

在诱导的E. coli培养物中观察到的荧光焦点证实了阻遏蛋白介导的复制阻断。

本实验采用携带pKM1质粒且该质粒含有四环素操纵子阵列的大肠杆菌（E. coli）菌株。pKM1编码TetR-YFP，即一种可诱导的、带有黄色荧光蛋白标签的四环素阻遏蛋白。

将该E. coli菌株的新鲜过夜培养物用含有所需抗生素的稀释型复杂培养基稀释至600纳米波长下的光密度值为0.01。在30摄氏度条件下振荡培养，使菌液光密度在600纳米波长下达到0.05至0.1。取10毫升样品作为未诱导对照。

向剩余的培养物中加入 0.01% 阿拉伯糖，以诱导 pKM1 质粒表达 TetR-YFP。将未诱导和已诱导的培养物在 30 °C 条件下振荡培养。一小时后，使用荧光显微镜检测已诱导培养物中每个细胞内是否出现单一焦点信号。

若诱导细胞被证实发生阻滞（以超过70%的细胞具有单一焦点为标志），记录光密度值，并取7.5毫升样品用于双向凝胶电泳分析。同时从未诱导的对照培养物中取等量样品。