使用受激拉曼散射显微镜检测细菌对抗生素的敏感性

从经过浓度递增的抗生素预处理的细菌样本开始，该抗生素可消除敏感性细菌。

向相应的试管中加入含有重水和相同抗生素浓度的培养基。

在振荡条件下孵育试管。

重水进入细菌细胞后，其中的氘会被整合到新合成的生物分子中，形成碳-氘键。

离心细菌，弃去上清液，并清洗。

加入固定剂以保存细菌结构。

加入水，离心，并移除上清液。

重悬细菌，并将菌液转移至多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上，然后密封。

将样品置于已预校准的受激拉曼散射（SRS）显微镜载物台上。加入水并降低物镜。

获取多个视野的图像以评估碳-氘振动频率。

在较高抗生素浓度下，碳-氘信号减弱，表明细菌活力下降。

这使得通过将SRS信号强度与细菌活力相关联，快速评估抗生素敏感性成为可能。

孵育1小时后，将700微升用含100%氘的MHB培养基进行系列稀释的抗生素加入到300微升经相同浓度抗生素预处理的细菌中。通过反复吹打数次使混合物混匀。作为阳性对照，将700微升不含抗生素的含100%氘的MHB培养基加入到300微升不含抗生素的细菌中。

加入700微升不含抗生素、含0%氘的MHB培养基至300微升不含抗生素的细菌中，作为阴性对照。将所有微量离心管在37摄氏度、每分钟200转的条件下孵育30分钟。孵育结束后，将1毫升经抗生素和氘处理的细菌样品在6,200 × g条件下离心 g 在4摄氏度下离心5分钟。随后用纯化水洗涤沉淀物两次。用体积分数为10%的甲醛溶液固定样品，并于4摄氏度保存。

样品制备时，用1毫升纯化水洗涤固定后的细菌溶液，并将洗涤后的细菌溶液在6,200 × g条件下离心 g 在4摄氏度下持续5分钟。

吸去上清液，用无菌水将细菌溶液浓缩至约20微升。将细菌溶液滴加到聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上，再用另一张盖玻片夹紧，并密封样品。将细菌样品置于显微镜载物台上，使用60倍水浸物镜进行观察。开始对细菌样品进行受激拉曼散射（SRS）成像。每个样品至少成像三个视野。