CRISPR介导的碱基编辑工具：一种诱导靶向碱基替换的基因组编辑技术

进行CRISPR介导的基因组编辑时，首先使用HAP1-BE3细胞系，该单倍体细胞系整合了编码碱基编辑酶的BE基因。向该细胞培养物中加入含有CRISPR-Cas9质粒的慢病毒载体，该质粒针对特定靶标设计，例如人类乳腺癌基因BRCA1。

慢病毒颗粒与宿主细胞膜融合，释放质粒，该质粒最终整合到宿主细胞基因组中，形成CRISPR-Cas9-BE基因片段。这些基因表达生成靶向BRCA1的gRNA、Cas9核酸内切酶以及BE胞苷脱氨酶。

BRCA1 基因靶向的 gRNA 是一种能与 Cas9 结合并引导该复合物定位至 BRCA1 基因位点的 RNA。在该基因位点附近存在一个原间隔序列邻近基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM），碱基编辑器（BE）可在此稳定结合，并向上游移动以到达其活性催化区域。在此位置，BE 识别一个胞嘧啶碱基并将其转化为尿嘧啶。

这种碱基替换突变会触发Cas9核酸酶切割未修饰的DNA链。DNA链断裂会激活修复酶，填补缺失的碱基，并将非DNA碱基尿嘧啶转化为胸腺嘧啶。总体而言，这些过程产生了一个基因变异体。

现在，在生理条件下培养细胞，并进行传代培养以扩增基因变异体。提取基因组DNA并进行测序，以分析CRISPR介导的碱基编辑效率。

转染前一天，将每孔 5 × 10⁵ 个 HAP1-BE3 细胞接种于 24 孔板中，培养至细胞融合度达到 70% 至 80% 以进行转染。根据生产商说明书，使用购买的转染试剂对靶向 BRCA1 的引导 RNA 进行转染。使用 1 微克靶向 BRCA1 的引导 RNA，在 BRCA1 靶位点诱导 CG 向 TA 的转换。随后，将细胞在 37 摄氏度下培养，并每 3 至 4 天传代一次。在转染后第 3、10 和 24 天收集细胞沉淀，以分析碱基编辑效率。使用基因组 DNA 纯化试剂盒提取基因组 DNA。