亲水相互作用液相色谱：一种利用亲水性微珠分离亲水极性分析物的技术

亲水相互作用液相色谱（HILIC）是一种根据极性化合物极性强弱对其进行分离的技术。首先，安装一根填充有携带极性官能团的亲水性微珠的HILIC色谱柱。

首先，使用平衡缓冲液和流动相（有机溶剂与水的混合物）对色谱柱进行预处理。缓冲液分子可稳定 pH，而有机溶剂则使色谱柱达到饱和。水分子固定并在亲水性微珠表面形成一层水化层。

加载含有荧光标记的糖链混合物（亲水性极性化合物）的样品。使用流动相梯度，以最佳流速通过色谱柱运行样品。

当样品在疏水性流动相中移动时，糖链会迁移至水相层，而杂质则被留在后面。随后，糖链向微珠上的极性官能团移动。在此过程中，极性较强的糖链结合牢固，而极性较弱的糖链结合较松散。

随着流动相疏水性的降低，极性较小且保留时间较短的弱结合糖链首先洗脱。相反，极性较高且保留时间较长的强结合糖链最后洗脱。

最后，检测器检测洗脱组分的荧光信号，该信号对应于色谱图中的标准糖链峰。

首先，打开控制流动相的软件。以0.2毫升/分钟的流速，用50%溶剂B和50%溶剂C冲洗UPLC仪器，持续30分钟。然后，以0.2毫升/分钟的流速，用25%溶剂A和75%溶剂B冲洗20分钟，随后将流速调整至0.4毫升/分钟继续冲洗。

将标记的 N-聚糖溶解于25微升体积比为2:1的100%乙腈与超纯水混合液中。随后，在4摄氏度下以134 × g 离心5分钟，并使用进样管将10微升上清液注入UPLC仪器中。

以每分钟0.4毫升的流速分离标记的N-聚糖，在25分钟内采用75%至62%乙腈的线性梯度。随后，在60摄氏度条件下，使用UPLC对葡聚糖校准梯度/糖肽柱进行分析运行。

在激发波长 330 纳米和发射波长 420 纳米的条件下检测 N-聚糖荧光。