反相高效液相色谱法：一种用于定量小鼠肝脏中分离的荧光标记及衍生化唾液酸的可靠方法

唾液酸（如N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸）是存在于哺乳动物细胞表面寡糖链末端的带负电荷的碳水化合物基团。

为了使用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）定量小鼠肝组织中这些唾液酸的相对含量，首先用衍生化试剂处理分离得到的唾液酸混合物。该衍生化试剂与唾液酸的功能基团发生反应，生成稳定且具有荧光的唾液酸衍生物。

组装一个与荧光检测器相连的反相高效液相色谱柱。该色谱柱包含以多孔硅胶为基质的固定相，其上键合有非极性、疏水性烷基链配体，可在色谱运行过程中促进与唾液酸衍生物的选择性相互作用。

使用含有低浓度乙腈（一种极性较低的有机溶剂）的水相极性流动相平衡色谱柱，以实现最佳的色谱柱预处理。

将衍生化的唾液酸混合物上样到色谱柱中。

含有疏水性N-乙酰基的N-乙酰神经氨酸比含有亲水性N-羟乙酰基的N-羟乙酰神经氨酸更强烈地吸附于固定相的疏水性配体上。

使用连接在线荧光检测器的标准高效液相色谱系统分析样品。分析时采用长度为 250 毫米、直径为 4.6 毫米的反相 C-18 色谱柱。

在配制好溶剂A和溶剂B，并按照文本方案中的详细步骤设置高效液相色谱（HPLC）运行条件后，将50微升样品注入HPLC系统中。

使用荧光检测器，激发波长为 373 纳米，发射波长为 448 纳米，监测洗脱液。

最后，按照文本方案中所述方法计算 Neu5Gc 的相对含量。