酶联免疫吸附测定法验证化学偶联的抗体-抗原结合物

为了引发免疫反应，抗原会结合树突状细胞（DCs）表面存在的内吞受体特异性的抗体，树突状细胞即抗原呈递细胞，有助于抗原的摄取。

抗体-抗原复合物的形成是一个关键步骤，可通过将抗原与靶向树突状细胞的单克隆抗体进行化学偶联在体外实现。

为了验证偶联过程的效率，首先使用预先包被了捕获抗体的ELISA板。用封闭液处理该板，以防止抗原与包被表面发生非特异性结合。

将化学交联的抗体-抗原复合物加入到孔板中，并进行孵育。抗原的特异性表位与捕获抗体的互补位结合，形成抗体-抗原-抗体复合物。

接着，将与酶连接的第三组抗体覆盖到板上。这些抗体可特异性结合存在于结合物中的初级抗体，从而实现对其的检测。

加入含有显色底物的缓冲液以显色结合物。连接在抗体上的酶与底物发生反应，生成有色产物。

用酸性失活溶液处理微孔板，使酶失活并终止反应。通过分光光度法分析微孔板。若出现有色溶液，则证实存在抗体-抗原偶联物，表明偶联成功。

为了通过 ELISA 验证偶联是否成功，用抗 OVA 抗体每孔 100 微升包被合适的 96 孔 ELISA 板，并在封闭缓冲液中以 1:2 的比例对抗 DEC-205/OVA 进行连续稀释，获得从每毫升 6 微克至每毫升 93.8 纳克的稀释梯度。

将每种稀释液各100微升加入已包被抗体的孔板中相应孔内，在室温下孵育1小时。孵育结束后，向孔板中加入100微升辣根过氧化物酶标记的针对抗DEC-205/OVA偶联物的抗体，在室温下继续孵育1小时。

然后，向每孔加入 50 µL 辣根过氧化物酶底物，以便通过分光光度法分析显色反应。