定量聚合酶链式反应法检测噬菌体数量

噬菌体的计数方法 通过 定量聚合酶链式反应，qPCR，配制含有 Taq DNA 聚合酶、引物、脱氧核苷三磷酸 — dNTPs — 及荧光报告染料分子的优化缓冲体系 qPCR 反应混合液，转移至 qPCR 板的各孔中。

加入热处理的噬菌体。热处理可使噬菌体DNA从噬菌体颗粒中释放出来。密封培养板，防止混合物蒸发。将培养板放入qPCR系统中，并设置适当的循环条件。

高温加热使双链DNA变性为单链，同时激活Taq DNA聚合酶。退火过程中，序列特异性的引物与互补的噬菌体DNA链结合。延伸阶段，活化的Taq DNA聚合酶在引物的3'端添加dNTPs，沿5'至3'方向延伸正在合成的DNA链。

染料分子插入新合成的双链DNA中，导致荧光强度增加。每经过一个PCR循环，目标DNA的数量增加一倍，荧光强度也随之增强。

确定荧光信号超过背景水平时的循环阈值（Ct）。

Ct 值与起始 DNA 量呈反比关系，每个噬菌体基因组相当于一个噬菌体颗粒，因此可通过噬菌体 DNA 标准曲线实现噬菌体的定量。

扩增后，进行熔解曲线分析，逐步升高反应温度。在特定的熔解温度下，一半的DNA解离为单链，释放染料分子，导致荧光信号突然下降。

独特的熔解温度（为qPCR产物特有）可验证产物的特异性。

为10个浓度未知的噬菌体生物淘选样品和7个标准浓度样品（每个样品设三个重复）配制qPCR预混液，共配制51个样品的预混液，包含255微升qPCR主混合液、51微升引物和102微升水。

将制备好的PCR混合液各8微升分装至96孔qPCR板的51个孔中。随后，向每个孔中加入2微升经热处理的T7噬菌体样品，加样时应将液体加至qPCR预混液液面以下。使用粘性封板膜密封反应板。

用铝箔包裹板以尽量减少荧光漂白，然后在qPCR仪器上运行该板。按照文本方案中所述设置循环条件和熔解曲线参数。