基于流式细胞术的树突状细胞活化分析——利用免疫复合物

从化学固定的肿瘤细胞悬液开始。

加入最佳浓度的肿瘤结合型免疫球蛋白G，该抗体可与肿瘤细胞表面抗原结合，形成免疫复合物（ICs）。

将免疫复合物转移至含有贴壁树突状细胞的培养板中。孵育。

树突状细胞识别免疫复合物，将其内化，并加工成肽段片段。

这些片段被加载到主要组织相容性复合体II类（MHC-II）分子上，并与共刺激分子CD86一起呈现在细胞表面。

移除培养基。加入细胞解离缓冲液，用力吹打以使细胞脱离。

将细胞转移至离心管中。

离心并用封闭溶液重悬细胞，以阻断非特异性相互作用。

使用靶向 MHC-II 和 CD86 的荧光染料标记抗体混合物进行孵育。

加入DNA结合染料，短暂孵育以染色死细胞核。

通过流式细胞术鉴定共表达 MHC-II 和 CD86 的活细胞，以确认免疫复合物介导的树突状细胞活化。

首先，在室温下用1.8%缓冲的多聚甲醛固定细胞10分钟。将细胞悬液接种至U型96孔板的每孔中。接着，在每孔中加入不同稀释度的肿瘤结合抗体。然后，将细胞在冰上孵育15至20分钟。

孵育后，用150微升磷酸盐缓冲液洗涤细胞，然后以400 × g离心 g 在4摄氏度下孵育5至10分钟。离心后，弃去上清液，并将细胞洗涤两次。用含有荧光素偶联二抗的100微升FACS缓冲液重悬细胞。随后，将培养板置于冰上孵育15至20分钟。

孵育15至20分钟后，加入200微升FACS缓冲液以洗涤细胞。在400 × g 条件下离心5至10分钟。弃去上清液。通过流式细胞术分析肿瘤结合情况，并确定包被细胞所需的免疫球蛋白G的最低浓度。

当细胞包被了最低浓度的免疫球蛋白G后，按1:5的比例将CFSE标记的肿瘤免疫复合物加入单核细胞来源的树突状细胞中。随后，在完全培养基中于37°C孵育12至16小时（过夜）。进行流式细胞术（FACS）分析以检测单核细胞来源的树突状细胞的活化情况。