通过悬滴法从小鼠胚胎干细胞生成神经前体细胞

取小鼠胚胎干细胞悬液。

离心，弃去上清液，并将细胞重悬于神经分化培养基中。

将悬液滴加到培养皿盖内侧。

在底部培养板中加入缓冲液，以防止液滴干燥。将盖板盖在底部培养板上，形成悬滴培养体系，并进行培养。

由于重力作用，细胞聚集并形成称为拟胚体（embryoid bodies 或 EBs）的三维聚集体。

将液滴放入含有分化培养基的培养板中，在振荡条件下孵育以促进拟胚体的形成。

离心并去除培养基；用添加了视黄酸的分化培养基重悬EBs，转移至培养板中，并进行培养。

视黄酸进入细胞后，触发转录复合物的形成。该复合物诱导基因表达，进而启动向神经前体细胞的分化。

分化后的EBs已准备好用于后续应用。

首先建立悬滴细胞培养。对于10厘米的细胞培养皿，将细胞浓度调整为每20微升分化培养基中含有500个细胞。准备足够量的细胞悬液，以制备50个20微升的液滴。使用微量移液器或重复移液器将20微升的细胞悬液滴加到组织培养皿盖内表面，确保各液滴之间保持适当距离，以防止其相互融合。

向培养板中加入 5 至 10 毫升 PBS，小心地将盖子重新盖好。将培养物置于 37 摄氏度的培养箱中孵育。两天后，收集盖子上的液滴，并将其转移至含有 10 毫升分化培养基的 10 厘米细胞悬浮培养板中。然后，将培养板置于培养箱内的摇床上，以低速振荡。再经过两天后，以 200 × g 离心 3 分钟，弃去上清液。

为了诱导类胚体分化为神经前体细胞，将细胞重悬于含有5 µM视黄酸的分化培养基中。将培养板孵育两天。随后，通过倾斜培养板并用移液器吸出，更换至少一半的培养基为新鲜培养基。