在与内皮细胞共培养的同时使用叠氮糖标记神经细胞表面标志物

首先，将小鼠脑微血管内皮细胞悬液加入到Transwell板的可渗透膜插件中。

向底部小室中加入培养基并进行孵育。

培养基中的生长因子和营养物质有助于细胞以单层形式生长。

从下室和插入物中移除培养基。

清洗插入物的内表面和外表面，以去除任何碎屑。

向插入物中加入贴壁培养基，并将插入物转移至含有原代皮层神经干细胞和祖细胞（NSPCs）的基质包被孔中，进行孵育。

向内皮细胞和NSPCs中加入叠氮糖（一种非天然的唾液酸前体类似物），并进行孵育。

内皮细胞分泌的细胞因子和趋化因子可促进神经干细胞/前体细胞生长形成大片状克隆。

叠氮糖可整合到NSPC细胞表面的唾液酸聚糖结构中，从而标记糖蛋白。这使得能够鉴定扩增后的NSPC细胞表面蛋白。

为准备内皮细胞，将一个在90%融合度的10厘米培养皿中的BEND3细胞沉淀用9毫升BEND3细胞培养基重悬。取1毫升细胞悬液加入一个可渗透支持性小室插入物中。在基质的下室每孔再加入2毫升BEND3培养基。将细胞在37°C、5%二氧化碳条件下继续培养一天。

接种细胞至小室后一天，先轻轻吸出下室中的培养基，再吸出小室内的培养基。用预热的DMEM洗涤小室表面三次。通过用预热的DMEM冲洗，洗涤小室外表面。接着，向一个小室中加入1毫升预热的AM。将小室转移至含有原代皮质神经元细胞的孔中。将共培养体系在37°C、5%二氧化碳条件下孵育12小时。

将 Ac₄ManNAz 溶于 DMSO 中，配制成 200 毫摩尔的储备液。从培养箱中取出神经-内皮细胞共培养板。向每个下室加入 1 微升 Ac₄ManNAz 储备液，每个插入物中加入 0.5 微升至共培养体系中。将细胞在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下培养 5 天。在细胞培养期间，每隔一天向每个插入物中加入 100 微升 RM，每个下室加入 200 微升 RM，以重新喂养内皮细胞和神经细胞。