将耳部祖细胞分化为感觉上皮细胞并进行免疫染色

在培养基中培养永生化的多能耳源祖细胞（iMOP细胞）。

培养基中的生长因子促进iMOP增殖和克隆形成，从而产生耳球体。 

收集耳球并让其自然沉降。

移除培养基，并加入不含生长因子的分化培养基。将耳球体接种。

缺乏生长因子会启动iMOP向感觉上皮细胞的分化。

收集已分化的耳球并使其沉降。

移除培养基，并加入固定剂以保存细胞形态。

接下来，加入去垢剂以通透细胞膜和核膜。

加入封闭缓冲液以防止非特异性抗体结合。

加入针对特定分化标志物的一抗。

加入针对一抗的荧光标记二抗、用于染色肌动蛋白的荧光标记鬼笔环肽，以及用于染色细胞核的DNA结合染料。

固定耳球体。

利用荧光显微镜观察染色情况，以确认 iMOP 的分化。

接种后第3天，采用重力沉降法收集耳球，方法如前所述。吸除上清液，将细胞轻轻重悬于2毫升感觉上皮分化培养基中。随后，使用10毫升大口径移液管将耳球转移至新的60毫米培养皿中。继续培养10天以诱导耳球分化，每隔一天向培养物中添加2毫升新鲜分化培养基。

随后，再次通过重力沉降收集耳球体，并吸除废弃培养基。接着，在室温下用含4%多聚甲醛的1×PBS固定耳球体15分钟。然后去除甲醛溶液，用含有0.1% Triton X-100的1×PBS洗涤细胞。随后用含有10%山羊血清和0.1% Triton X-100的1×PBS对耳球体进行封闭处理。

孵育一小时后，将封闭缓冲液更换为含有适当稀释倍数的Cdkn1b或Cdh1抗体的缓冲液。然后在4摄氏度下与一抗孵育过夜，次日按照其他部分所述方法，使用荧光标记的二抗、鬼笔环肽（phalloidin）和Hoechst继续进行免疫染色。

为进行成像，先在载玻片上滴加封片剂，然后将染色后的耳球体转移至封片剂中。接着，将盖玻片覆盖在样品上。在4摄氏度下避光静置过夜，使封片剂干燥后，将载玻片置于配备16位CCD相机的倒置显微镜载物台上。使用20倍、数值孔径0.75的平场消色差物镜，通过采集蓝色、绿色、红色和红外通道的荧光信号，获取落射荧光图像。