使用荧光激活细胞分选法分离小鼠视网膜神经节细胞

将小鼠视网膜置于湿润的细胞筛网上，以环形运动研磨，以分离视网膜细胞与细胞外基质。

将滤网转移至收集管中。

向滤网中加入磷酸盐缓冲液和血清溶液，以洗涤并收集细胞。

离心以沉淀细胞。弃去上清液，并将细胞重悬于磷酸盐缓冲液和血清溶液中。

加入可结合细胞表面 Fc 受体的封闭抗体，以防止目的抗体的非特异性结合。

接下来，加入针对不同细胞类型表面特定标记物的荧光标记和未标记的一抗。

洗涤以去除未结合的抗体。

加入荧光标记的二抗，以结合未标记的一抗。

洗涤以去除未结合的抗体。

通过荧光激活细胞分选（FACS）捕获标记细胞的特异性荧光信号，并从多种视网膜细胞群体中分选出视网膜神经节细胞。

将最多12个视网膜置于已用PBS和FBS润湿的无菌70微米尼龙筛网上，使用10毫升注射器活塞的尾端以环形运动轻轻研磨视网膜组织。当所有细胞均已解离后，将筛网置于聚丙烯收集管上方，用P1000移液器将细胞悬液经筛网过滤至收集管中。

用 PBS 和 FBS 冲洗滤网，将洗涤液收集至收集管中。加入足够的 PBS 加 FBS，使最终溶液体积达到每视网膜 1 毫升，然后通过离心收集细胞。接着，将沉淀重悬于 PBS 加 FBS 中，每 5 个视网膜使用 1 毫升培养基的浓度。接下来，在每管中加入抗小鼠 CD16/32 抗体，每 1 × 10⁶ 个细胞加入 1 微升，室温孵育 10 分钟，以阻断任何非特异性 FC 受体结合。

封闭孵育结束后，轻轻吹打加入适量的抗体混合液，冰上避光孵育30分钟。随后，用终体积为4毫升的PBS和FBS溶液洗涤细胞两次。加入合适的二抗，冰上避光标记30分钟，再用含FBS的PBS洗涤两次，将样品管上机进行流式细胞术检测。