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神经科学
0 次观看 • 3:29 分钟 • July 8th, 2025
取在包被有细胞外基质的培养板上培养的人诱导性多能干细胞（iPSC）克隆。
iPSCs 经过基因改造，可表达诱导运动神经元分化的转录因子。
移除培养基并加入酶以解离菌落。
将细胞机械性解离成单细胞悬液并收集。
离心并弃去上清液。
将细胞重悬于含有抑制细胞凋亡的抑制剂的培养基中。
将细胞接种于基质包被的培养皿中。
加入含有抗生素多西环素和小分子抑制剂的新鲜分化培养基。
多西环素诱导转录因子表达，而抑制剂则阻断特定信号通路，促进诱导多能干细胞分化为运动神经元前体细胞。
加入酶以解离细胞。
收集细胞并进行机械解离。
离心并弃去上清液。用神经元培养基重新悬浮细胞。
将细胞接种于包被有黏附蛋白的微孔板上，以促进细胞黏附。
培养基中的生长因子诱导前体细胞成熟为运动神经元。
对于运动神经元分化，使用解离试剂将稳定转染的细胞培养物进行解离，以便将细胞收集至含有5倍体积DMEM/F12培养基的15毫升离心管中。离心后，将细胞重悬于添加了微摩尔浓度ROCK抑制剂的人iPSC培养基中进行计数。
将细胞以每平方厘米 6.25 × 104 个细胞的密度接种于基质包被的培养皿中。接下来两天，用新鲜的分化培养基替换上清液，培养基中需添加多西环素。
第二天，更换为添加了γ-分泌酶抑制剂、血管内皮生长因子受体抑制剂和多西环素的Neurobasal B27培养基。第五天，按所示方法消化细胞，并将脱落的细胞重悬于4毫升DMEM/F12培养基中进行计数。
移液对于细胞的完全解离至关重要。
冷冻一个 等分试样 按照说明书中的指示，将运动神经元前体细胞置于细胞冻存液中，其余细胞通过离心收集。将细胞沉淀重悬于添加了10微摩尔ROCK抑制剂的神经元培养基中。
将细胞以每平方厘米1 × 105个细胞的密度接种于多聚鸟氨酸-层粘连蛋白包被的带聚合物盖玻片的微孔载片上。第6天时，小心更换为新鲜的神经元培养基，不添加抑制剂，继续培养至下游分析，期间避免细胞从支撑表面脱落。