Name: CRISPR/Cas9在iPSC衍生肌肉预祖中恢复肌营养不良素表达的技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 了解CRISPR/Cas9基因编辑技术在iPSC衍生肌肉预祖细胞中恢复肌营养不良素表达的方法。该技术通过Tet-on MyoD系统诱导分化，为杜氏肌营养不良症提供自体细胞治疗新策略。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

唐和温特劳布部分得到了 NIH-AR070029、NIH-HL086555、NIH-HL134354 的资助。

所有动物操作和手术程序均按照奥古斯塔大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行。小鼠自由摄取标准饮食和水。
1. 从成年 Dmdmdx 小鼠中分离原代小鼠成纤维细胞
<ol>
	<li>根据奥古斯塔大学佐治亚医学院动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案，通过 CO2 窒息法和开胸术处死成年 Dmdmdx 小鼠（雄性，2 月龄）。在超净工作台的无菌条件下，使用无菌手术刀剪下尾部。用 70% 乙醇冲洗尾部 5 分钟，然后在 6 cm 培养皿中用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。</li>
	<li>沿尾部皮肤从基部至尾尖做一锐性切口，剥离尾部皮肤，再用镊子轻轻将皮肤撕下。使用无菌手术刀将皮肤组织剪碎至约 1 mm3 大小，并将剪碎的皮肤组织转移至含有 0.1% 胶原酶 IV 和 1 U/mL 分散酶的杜尔贝科改良必需培养基/汉姆 F12 培养基（DMEM/F12）的 6 cm 培养皿中。</li>
	<li>将皮肤组织置于培养皿中，在 37 °C、5% CO2 培养箱中消化 2 小时。</li>
	<li>用纤连蛋白和 0.2% 明胶（1 mL 纤连蛋白溶于 199 mL 0.2% 明胶中；材料表）包被 6 孔板，并在 37 °C 下孵育 1 小时。</li>
	<li>用 1 mL 移液枪头将消化后的皮肤组织吹打分散，转移组织及上清液至无菌 15 mL 圆锥形离心管中。在室温下以 217 × g 离心 3 分钟，弃去上清液，将沉淀物重悬于 1.5 mL 成纤维细胞培养基中（材料表）。</li>
	<li>将包含未完全消化皮肤组织的沉淀物接种于第 1.4 步中已用纤连蛋白和 0.2% 明胶包被的 6 孔板中，在 37 °C、5% CO2 培养箱中进行培养。初次接种后 24 小时更换培养基以去除未贴壁细胞，之后每 48 小时更换一次培养基。</li>
</ol>
2. 将小鼠皮肤成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞
<ol>
	<li>转导前两天，用细胞脱离溶液（材料表）在37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中消化步骤1.6获得的小鼠真皮成纤维细胞，持续5分钟。</li>
	<li>使用血细胞计数板计数细胞，并在217 × g 条件下离心3分钟。</li>
	<li>以每孔1−2 × 105个细胞的密度将细胞接种至6孔板中，加入成纤维细胞培养基（材料表），在37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中培养。</li>
	<li>转导当天（第0天），估算细胞数量，根据商品化说明书计算每种病毒所需的体积，以达到目标感染复数（MOI）分别为5、5和3（即KOS MOI = 5，hc-Myc MOI = 5，hKlf4 MOI = 3）。</li>
</ol>
<img alt="病毒体积计算公式；病毒学研究中的感染复数（MOI）公式示意图。" src="/files/ftp_upload/59432/59432equ01.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="公式 1">
<ol start="5">
	<li>将三管仙台病毒在 37 °C 水浴中解冻 5−10 秒，并将每管仙台病毒按计算体积加入 1 mL 成纤维细胞培养基中（材料表）。</li>
	<li>移除步骤 2.3 中的成纤维细胞培养基，将重编程病毒混合液加入含细胞的孔中。将细胞置于 37 °C、5% CO2 湿润环境的培养箱中过夜培养。</li>
	<li>转导后 24 小时更换为新鲜的成纤维细胞培养基。此后每两天更换一次培养基，继续培养细胞一周。</li>
	<li>转导后第 7 天，用 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 收集感染的小鼠成纤维细胞，并接种至预先包被纤维连接蛋白和 0.2% 明胶的培养皿中。</li>
	<li>将步骤 2.6 中获得的感染小鼠成纤维细胞置于含完全小鼠胚胎干细胞（ES）生长培养基（材料表）的培养皿中，在 37 °C、5% CO2 湿润环境的培养箱中培养，并每天更换培养基。</li>
	<li>从第 8 天开始，每隔一天在倒置显微镜下观察培养皿，识别具有小鼠胚胎干细胞形态的细胞集落的出现。</li>
</ol>
3. 使用碱性磷酸酶活细胞染色与流式细胞术定量重编程效率
<ol>
	<li>移除每个孔中的培养基，并用DMEM/F-12冲洗1−3分钟。</li>
	<li>向贴壁细胞中加入2 mL 1×碱性磷酸酶（AP）活细胞染色工作液（以DMEM/F-12按1:500稀释），在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中孵育30分钟。</li>
	<li>吸去AP活细胞染色液，用PBS洗涤两次，每次5分钟。</li>
	<li>使用细胞解离液（材料表）在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中消化细胞5分钟。进行流式细胞术以测定重编程效率。</li>
</ol>
4. 选择与收获类胚胎干细胞
<ol>
	<li>在倒置显微镜下观察步骤 2.8 中的菌落。</li>
	<li>使用自印式标记笔在培养皿底部标记菌落位置。</li>
	<li>将涂有油脂的克隆环置于标记的细胞菌落上。每个克隆环中加入 100 μL 0.05% 胰蛋白酶/EDTA，于 37 °C 孵育 5 分钟，然后用 100 μL 移液枪头将消化后的细胞转移至含有 mES 生长培养基的 48 孔培养板中。</li>
	<li>将细胞置于 37 °C、5% CO2 湿润环境的培养箱中，在 48 孔培养板中继续培养。当细胞融合度达到 70% 时，传代至 6 cm 培养皿中。</li>
	<li>重复步骤 4.3 和 4.4 数次，直至获得形态均一的穹顶状克隆。</li>
</ol>
5. 冻存诱导多能干细胞以进行低温保存
<ol>
	<li>在37 °C、5% CO2培养箱中，使用胰蛋白酶、versene和鸡血浆（TVP；材料表）溶液处理第4.5步选定的iPSCs，消化30分钟。</li>
	<li>将细胞收集至无菌15 mL锥形管中，在室温下以217 × g离心3分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将细胞沉淀重悬于2 mL小鼠ES冻存液（材料表）中，每支冻存管分装1 mL。</li>
	<li>将细胞加入冻存管中，并使用冷冻容器进行冷冻，确保以-1 °C/min的关键降温速率在-80 °C过夜冷冻，以满足冻存要求。</li>
	<li>将冻存管转移至液氮罐中保存。</li>
</ol>
6. iPSCs中干细胞标志物的免疫荧光染色
<ol>
	<li>将5.1步骤中使用mES培养基培养的iPSCs以适当密度接种于涂有聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白的8孔腔室载玻片上（材料表），每孔细胞数控制在1−2 × 104个，随后在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育48小时。</li>
	<li>室温下将载玻片浸入4%多聚甲醛中固定15分钟，再将载玻片浸入PBS中洗涤两次，每次5分钟。</li>
	<li>在室温下用小鼠IgG封闭试剂（材料表）和5%山羊血清孵育切片1小时。</li>
	<li>用蛋白稀释液稀释一抗（小鼠抗SSEA1抗体，1:100；兔抗Nanog抗体，1:500；兔抗POU类5同源框1 [OCT4] 抗体，1:500；兔抗SRY-box 2 [SOX2] 抗体，1:500；兔抗Lin-28同源物A [Lin28A] 抗体，1:400）（材料表），将抗体溶液加入细胞样本，于湿化 chamber 中4 °C孵育过夜。</li>
	<li>弃去一抗溶液，用PBS洗涤载玻片3次。</li>
	<li>将二抗（Alexa488标记的山羊抗小鼠抗体和Alexa555标记的山羊抗兔抗体，均按1:400稀释）溶于M.O.M.蛋白稀释液后加入载玻片，室温孵育45分钟。</li>
	<li>用PBS洗涤载玻片3次，然后使用含4’6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂封片。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜拍摄图像。</li>
</ol>
7. 体内研究诱导多能干细胞的多能性
<ol>
	<li>使用TVP溶液在37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中将第5.1步的iPSCs消化为单细胞，孵育30分钟。</li>
	<li>用血细胞计数板计数细胞，并在217 × g 条件下离心3分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1.5 mL无菌离心管中的mES培养基中，浓度为5 × 105 个细胞/30 μL，用于细胞移植。</li>
	<li>使用毛发修剪器去除免疫缺陷小鼠双侧后肢的毛发。</li>
	<li>用氯胺酮（100 mg/kg）麻醉小鼠，并用75%酒精清洁注射部位。</li>
	<li>使用31 G针头将第7.3步制备的30 μL iPSC悬液注射至腓肠肌内。</li>
	<li>注射后两周，取小鼠腓肠肌组织，包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，速冻后切成5-μm厚的切片15,16。</li>
	<li>室温下用4%多聚甲醛固定切片15分钟，然后将载玻片在PBS中洗涤两次，每次5分钟。</li>
	<li>用5%山羊血清蛋白稀释液在室温下封闭细胞1小时。</li>
	<li>向载玻片上加入稀释的一抗（兔抗AFP抗体，1:50；兔抗SMA抗体，1:50；兔抗TH抗体，1:50），在湿盒中4 °C孵育过夜。</li>
	<li>弃去一抗溶液，用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟；加入1:400稀释的Alexa555标记的山羊抗兔抗体，室温孵育45分钟。</li>
	<li>用PBS洗涤载玻片3次，每次5分钟，然后用含DAPI的封片剂封片。</li>
</ol>
8. 靶向 dystrophin 外显子 23 侧翼内含子的 CRISPR/Cas9 慢病毒载体的构建
<ol>
	<li>通过 http://crispor.tefor.net/crispor.py 设计两对靶向内含子包围的抗肌萎缩蛋白外显子23的gRNA寡核苷酸。 
	注意：设计的引物对如下： 
	i22sense: 5’-CACCGTTAAGCTTAGGTAAAATCAA- 3’ 
	i22anti-sense: 5’-AAACTTGATTTTACCTAAGCTTAAC-3’ 
	i23sense: 5’-CACCGAGTAATGTGTCATACCTTCT- 3’ 
	i23anti-sense: 5’-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3’）。</li>
	<li>使用BsmB1/Esp3I在37 °C下对5 µg慢病毒CRISPR质粒（lenti-CRISPRv2-blast [由Mohan Babu惠赠] 和 lenti-Guide-Hygro-iRFP670 [由Kristen Brennand惠赠]）（材料表）进行消化和去磷酸化处理，反应30分钟。对于5 µg质粒，加入3 µL BsmB1限制性内切酶、3 µL快速碱性磷酸酶、6 µL 10x酶切缓冲液和0.6 µL 100 mM DTT，总体积为60 µL。</li>
	<li>将反应产物上样至0.8%琼脂糖凝胶中，在100−150 V电压下电泳30分钟。</li>
	<li>使用凝胶回收试剂盒（材料表）从凝胶中纯化消化后的质粒，并用20 µL H2O洗脱。</li>
	<li>对每对gRNA寡核苷酸进行磷酸化和退火处理：每对包含1 µL 100 µM的寡核苷酸、1 µL 10x T4连接酶缓冲液、0.5 µL T4多核苷酸激酶（PNK）和6.5 µL ddH2O，在37 °C孵育30分钟，随后95 °C加热5分钟，再以5 °C/min速率降温至25 °C。</li>
	<li>将退火后的gRNA寡核苷酸稀释200倍后连接至plentiCRISPR V2-Blast或plentiGuide-Hygro-iRFP670载体中。在11 µL反应体系中混合50 ng经BsmB1/Esp3I消化的载体、1 µL稀释后的寡核苷酸双链以及5 µL 2x连接酶缓冲液和1 µL连接酶，在室温下孵育10分钟。</li>
	<li>按照生产商说明书，将3 µL连接产物转化至50 µL感受态细胞（材料表）中。</li>
	<li>将转化后的感受态细胞涂布于含100 µg/mL羧苄青霉素的琼脂平板上，在31.5 °C培养18小时。</li>
	<li>用10 µL无菌枪头挑取单克隆，在含100 µg/mL羧苄青霉素的5 mL优质肉汤培养基（材料表）中，于31.5 °C、185 rpm摇床培养箱中培养21小时。</li>
	<li>使用质粒小提和中提试剂盒（材料表）纯化质粒DNA。</li>
	<li>通过限制性酶切验证小提质粒。在20 µL反应体系中加入1 µg质粒DNA、2 µL酶切反应缓冲液（材料表）和1 µL限制性内切酶混合液（plentiCRISPR V2-Blast-i22使用0.5 µL KpnI-HF和0.5 µL AgeI-HF；plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23使用0.5 µL NotI-HF和0.5 µL EcoRI-HF），在37 °C孵育1小时。</li>
	<li>将反应产物上样至0.8%琼脂糖凝胶中，在100−150 V电压下电泳30分钟。 
	注意：plentiCRISPR V2-Blast-i22的正确条带应为622 bp和12.2 kb，plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23的正确条带应为2.6 kb和7.1 kb。</li>
</ol>
9. 慢病毒载体包装
<ol>
	<li>在6 cm培养皿中，将7 × 105个293FT细胞接种于5 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2条件下过夜培养。</li>
	<li>配制转染混合液（在100 µL低血清MEM培养基中加入1 µg plentiCRISPR V2-Blast-i22或plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23质粒、750 ng psPAX2包装质粒、250 ng pMD2.G包膜质粒，以及5 µL转染试剂A [材料表]）。</li>
	<li>在100 µL低血清MEM培养基中加入5 µL转染试剂B（材料表），配制混合液。</li>
	<li>将100 µL转染试剂B混合液加入步骤9.2中的质粒混合液中，室温孵育5分钟。</li>
	<li>将步骤9.4中形成的DNA-脂质复合物逐滴加入293FT细胞中，于37 °C、5% CO2条件下过夜孵育。</li>
	<li>次日向每块培养皿中加入病毒生产增强剂（500倍浓缩液）（材料表），于37 °C、5% CO2条件下继续孵育24小时。</li>
	<li>在接下来的两天中，使用移液器收集细胞培养上清液，并通过0.45 µm滤膜过滤，以去除细胞。</li>
</ol>
10. 慢病毒载体的浓缩与纯化
<ol>
	<li>在4 °C条件下，用5倍体积的聚乙二醇4000（PEG4000，终浓度为8.5%）和4 M NaCl（终浓度为0.4 M）将第9.7步培养基中的慢病毒载体沉淀过夜。</li>
	<li>将含有PEG4000溶液的病毒培养基在2,095 × g、4 °C条件下离心30分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用500 µL低血清MEM培养基重悬沉淀（慢病毒滴度：lenti-CRISPR V2-gRNAi22：1.56 × 108，lenti-iRFP670-gRNAi23：1.3 × 108，lenti-CRISPR V2-control：3.13 × 107，lenti-iRFP670-control：5.9 × 107）。保存于-80 °C，待用。</li>
</ol>
11. 利用两种向导RNA（gRNA）与Cas9联用在小鼠iPSCs中删除第23外显子
<ol>
	<li>将步骤 4.5 中的小鼠诱导多能干细胞（iPSCs）接种于经纤连蛋白和明胶包被的 24 孔板中。</li>
	<li>待细胞达到 50% 汇合度后，更换为新鲜培养基（完全小鼠胚胎干细胞生长培养基），其中含有 8 µg/mL 多聚素（polybrene）。</li>
	<li>向小鼠 iPSCs 中加入 100 µL 来自步骤 10.3 的慢病毒颗粒溶液，包括 lenti-CRISPR V2-gRNAi22、lenti-iRFP670-gRNAi23 以及对照（空载体：lenti-CRISPR V2、lenti-iRFP670）。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育细胞 3 天。</li>
	<li>使用含有 2.5 µg/mL 杀稻瘟菌素（blasticidin）和 100 µg/mL 潮霉素 B 的培养基筛选稳定感染的细胞，筛选浓度依据杀死未感染细胞所需的最低杀稻瘟菌素和潮霉素 B 浓度确定。 
	注意：未感染的细胞会被杀稻瘟菌素和潮霉素 B 杀死。</li>
	<li>每孔（24 孔板）加入 0.5 mL TVP 溶液消化筛选后的小鼠 iPSCs，并在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 30 分钟。</li>
	<li>通过移液将 iPSCs 解离为单细胞，使用细胞计数板计数细胞，然后将约 150 个消化后的单细胞用 mES 培养基稀释后接种至 10 cm 培养皿中，在 37 °C、5% CO2 条件下继续培养。</li>
	<li>约 10 天后，在倒置显微镜下使用 10 µL 无菌移液器吸头挑取单克隆（需挑取 96 个克隆）。</li>
	<li>将挑取的克隆转移至 96 孔板中，每孔加入 50 µL TVP 溶液（每孔一个克隆），在 37 °C 下消化 30 分钟，然后将消化后的细胞接种至两个 96 孔培养板中继续培养（其中一个用于基因型鉴定）。</li>
	<li>在 37 °C 的 CO2 培养箱中孵育，直至细胞汇合度达到 70%。</li>
</ol>
12. 鉴定外显子23缺失的iPSC克隆
<ol>
	<li>当细胞集落达到70%融合度时，移除96孔板中的培养基。</li>
	<li>向每孔加入含有蛋白酶K溶液的裂解试剂（25 µL）（材料表）（每100 mL裂解试剂中含1 mL蛋白酶K），并将裂解液转移至96孔PCR板中。</li>
	<li>密封PCR板，先在55 °C孵育30分钟，然后在95 °C孵育45分钟，以裂解细胞并使蛋白酶K失活。</li>
	<li>取步骤12.3中获得的2 µL裂解液进行PCR反应。对于20 µL的PCR反应体系，加入2 µL裂解液、10 µL 2x DNA聚合酶预混液（材料表）、7 µL无DNase水和1 µL DMD外显子23引物（表1）。</li>
	<li>PCR反应程序如下：98 °C预变性1分钟，随后进行35个循环（98 °C变性10秒、60 °C退火15秒、72 °C延伸30秒），最后在72 °C延伸1分钟。</li>
	<li>将PCR产物上样至2%琼脂糖凝胶，在100−150 V电压下电泳30分钟。</li>
	<li>在紫外光下观察凝胶结果（敲除效率为3/94）。</li>
</ol>
13. 使用 Tet-on MyoD 激活系统将诱导多能干细胞直接分化为成肌祖细胞（MPC）
<ol>
	<li>按照第9和第10节中针对lenti-CRISPRv2-blast和lenti-gRNA-iRFP670载体所述的方法，包装LV-TRE-VP64-小鼠MyoD-T2A-dsRedExpress2和LV-TRE-VP16小鼠MyoD-T2A-dsRedExpress2（由Charles Gersbach惠赠）（材料表）。</li>
	<li>按照步骤11.1−11.3中针对lenti-CRISPRv2-blast和lenti-gRNA-iRFP670载体所述的方法，用慢病毒-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2或慢病毒-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2感染小鼠iPSC。</li>
	<li>感染三天后，使用1 μg/mL嘌呤霉素筛选细胞，以获得纯化的转导细胞群体。</li>
	<li>向培养基（含10% FBS的DMEM）中添加3 μg/mL多西环素以诱导MPC分化。每两天更换一次含多西环素的新鲜培养基。</li>
</ol>
14. 定量逆转录 PCR 用于评估动态肌肉分化及 DMD 外显子 22-24 的表达
<ol>
	<li>使用RNA提取试剂，在多西环素处理后的第0、3、6和10天提取细胞RNA，并利用第一链cDNA合成试剂盒（材料表）将RNA逆转录为cDNA。</li>
	<li>对于20 µL的qPCR反应体系，加入1 µL cDNA、10 µL PCR反应缓冲液（材料表）、8 µL DNA H2O，以及1 µL的上下游引物混合物（甘油醛-3-磷酸脱氢酶[GAPDH]、骨骼肌肌动蛋白[ACTA1]、OCT4以及DMD外显子22、DMD外显子23和DMD外显子24，见表1）。</li>
	<li>PCR反应使用以下参数：50 °C 2分钟，95 °C 2分钟，40个循环（95 °C 15秒，60 °C 1分钟），熔解曲线分析从65.0 °C升至95.0 °C，增量为0.5 °C。</li>
</ol>
15. 肌球蛋白重链2（MYH2）和肌营养不良蛋白表达的免疫荧光染色
<ol>
	<li>将步骤13.4中经强力霉素诱导并用lenti-TRE-MyoD修饰的细胞接种至8孔培养载玻片上。</li>
	<li>在室温下用4%多聚甲醛固定细胞15分钟，然后用PBS洗涤载玻片两次，每次5分钟。</li>
	<li>用5%山羊血清蛋白稀释液在室温下封闭细胞1小时。</li>
	<li>向载玻片上加入兔抗dystrophin抗体（1:300）和鼠抗MYH2抗体（1:100），于4 °C湿盒中孵育过夜。</li>
	<li>弃去一抗溶液，用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟；然后向载玻片加入1:400稀释的Alexa488标记的山羊抗兔抗体和Alexa555标记的山羊抗鼠抗体，室温孵育45分钟。</li>
	<li>用PBS洗涤载玻片3次，每次5分钟，最后用含DAPI的封片剂封片。</li>
</ol>

<ol><li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).</li>
<li>Batchelor, C. L., Winder, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sparks%2C+signals+and+shock+absorbers%3A+how+dystrophin+loss+causes+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy.</a> Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).</li>
<li>Gregorevic, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+delivery+of+genes+to+striated+muscles+using+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors.</a> Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).</li>
<li>Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+prospects+of+gene+therapy+clinical+trials+for+the+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies.</a> Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).</li>
<li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+editing+in+dystrophic+mouse+muscle+and+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells.</a> Science. 351 (6271), 407-411 (2016).</li>
<li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+genome+editing+partially+restores+dystrophin+expression+in+a+mouse+model+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy.</a> Science. 351 (6271), 400-403 (2016).</li>
<li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+improves+muscle+function+in+a+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 351 (6271), 403-407 (2016).</li>
<li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+muscular+dystrophy+in+mice+by+CRISPR%2FCas9-mediated+editing+of+germline+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA.</a> Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).</li>
<li>El Refaey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Cardiac+Function+in+Dystrophic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice.</a> Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).</li>
<li>Amoasii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+editing+restores+dystrophin+expression+in+a+canine+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 362 (6410), 86-91 (2018).</li>
<li>Eisen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+abnormalities+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+generated+from+Duchenne+muscular+dystrophy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).</li>
<li>Marion, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+acquire+embryonic+stem+cell+characteristics+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).</li>
<li>Dumont, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+expression+in+muscle+stem+cells+regulates+their+polarity+and+asymmetric+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).</li>
<li>Sacco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+telomeres+and+stem+cell+exhaustion+model+Duchenne+muscular+dystrophy+in+mdx%2FmTR+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice.</a> Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).</li>
<li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Transplantation+of+Myogenic+Progenitor+Cell+Derived+Exosomes+to+Improve+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li>
<li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-Derived+Dystrophin+from+Allograft+Myogenic+Progenitors+Improves+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).</li>
<li>Ousterout, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+CRISPR%2FCas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 6, 6244(2015).</li>
<li>Barde, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+control+of+gene+expression+in+the+hematopoietic+system+using+a+single+Tet-on+inducible+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).</li>
<li>Glass, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+cartilage+with+inducible+and+tunable+immunomodulatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties.</a> Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

杜氏肌营养不良症（DMD）是一种破坏性且最终致命的遗传性疾病，其特征是缺乏抗肌萎缩蛋白，导致进行性肌肉萎缩1，2。我们的结果表明，通过CRISPR/Cas9介导的外显子23删除方法，可在Dmdmdx诱导多能干细胞来源的成肌祖细胞中恢复抗肌萎缩蛋白基因的表达。该方法具有三个优势。
首先，我们利用非整合型RNA载体，从小鼠Dmdmdx模型来源的皮肤成纤维细胞中生成诱导性多能干细胞（iPSCs）。目前已有多种方法可用于生成iPSCs，例如使用慢病毒和逆转录病毒载体，这些载体可整合到宿主染色体中以表达重编程基因，因而存在一定的安全性问题。基于DNA的载体，如质粒载体、腺相关病毒和腺病毒，虽以非整合形式存在，但仍可能以较低频率整合入宿主染色体。在本研究中，我们采用了一种经过修饰的、无传染性的仙台病毒——一种非整合型RNA载体，以安全高效地将干细胞转录因子递送至成纤维细胞，实现重编程。
<p class="jove_conte...

杜氏肌营养不良症（DMD）是最常见的肌营养不良症之一，其特征为肌营养不良蛋白缺失，在全球范围内约每5,000名新生男婴中就有1例受到影响1. 抗肌萎缩蛋白基因功能的丧失会导致肌肉结构缺陷，进而引起肌纤维进行性退化1,2重组腺相关病毒（rAAV）介导的基因治疗系统已用于恢复抗肌萎缩蛋白的表达并改善肌肉功能，例如采用微型抗肌萎缩蛋白（µ-Dys）进行基因替代治疗。然而，rAAV 方法需要重复注射以维持功能性蛋白的表达3,4因此，我们需要一种能够有效且永久恢复杜氏肌营养不良症（DMD）患者 dystrophin 基因表达的策略。&#160;Dmdmdx 小鼠，一种DMD的小鼠模型，在外显子23中存在一个点突变&#160;dystrophin&#160;引入提前终止密码子的基因，导致产生缺乏C末端肌营养不良糖蛋白结合域的非功能性截短蛋白。近期研究表明，利用CRISPR/Cas9技术可通过精确基因修复或突变外显子删除，在小型和大型动物中恢复抗肌萎缩蛋白基因的表达。5,6,7. Long 等8 报道了用于校正 Dmd 基因中抗肌萎缩蛋白基因突变的方法mdx 利用基于同源定向修复（HDR）的CRISPR/Cas9基因组编辑技术对小鼠生殖系进行基因修饰。El Refaey 等9 报道称，rAAV可有效切除营养不良小鼠中突变的外显子23。在这些研究中，gRNA靶向设计于内含子20和23，以诱导双链DNA断裂，随后通过非同源末端连接（NHEJ）介导的DNA修复，部分恢复了肌营养不良蛋白的表达。更令人振奋的是，Amoasii等10 最近报道了rAAV介导的CRISPR基因编辑在犬模型中恢复抗肌萎缩蛋白表达的有效性和可行性，这是未来临床应用的关键步骤。
DMD 还会导致干细胞功能障碍11。当肌肉受损时，组织驻留的肌肉干细胞会在肌肉分化后补充死亡的肌细胞。然而，反复的损伤与修复循环会导致肌肉干细胞中的端粒缩短12，并引起干细胞库的过早耗竭13,14。因此，将自体干细胞治疗与基因组编辑相结合以恢复抗肌萎缩蛋白的表达，可能是治疗 DMD 的一种可行策略。CRISPR/Cas9 技术为生成自体基因纠正的诱导性多能干细胞（iPSC）提供了可能，从而实现功能性肌肉再生，并在不引发免疫排斥的情况下防止 DMD 的进一步并发症。然而，iPSC 存在致瘤风险，这一问题可通过将 iPSC 分化为成肌祖细胞来缓解。
在本实验方案中，我们描述了使用非整合型仙台病毒将 Dmdmdx 小鼠的皮肤成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs），然后通过 CRISPR/Cas9 基因组删除恢复抗肌萎缩蛋白的表达。在通过基因分型验证 iPSC 中外显子 23 的删除后，我们通过 MyoD 诱导的成肌分化，将基因组修复的 iPSCs 分化为成肌祖细胞（MPC）。

<table><tbody><tr><td>手术器械</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>31号针头</td><td>Various&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>锐性切开工具</td><td>Various&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌手术刀</td><td>Various&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Various&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>成纤维细胞培养基（配制100 mL完全培养基）</td><td>公司</td><td>货号</td><td>体积</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇（55 mM）</td><td>Gibco</td><td>21-985-023</td><td>0.1 mL</td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素溶液（100倍浓缩）</td><td>CORNING</td><td>MT30004CI</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>DMEM高糖培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose）</td><td>SIGMA</td><td>D6429</td><td>87 mL</td></tr><tr><td>经鉴定的胎牛血清</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺溶液</td><td>SIGMA</td><td>G7513</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>TVP溶液（配制500 mL完全溶液）</td><td>公司</td><td>货号</td><td>体积</td></tr><tr><td>鸡血清</td><td>Gibco</td><td>16110-082</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>186 mg</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td></td><td></td><td>加至500 mL</td></tr><tr><td>胰蛋白酶（2.5%）</td><td>Thermo</td><td>15090046</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>mES细胞生长培养基（配制500 mL完全溶液）</td><td>公司</td><td>货号</td><td>体积</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇（55 mM）</td><td>Gibco</td><td>21-985-023</td><td>0.5 mL</td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素溶液（100倍浓缩）</td><td>CORNING</td><td>MT30004CI</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>DMEM高糖培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose）</td><td>SIGMA</td><td>D6429</td><td>408.5 mL</td></tr><tr><td>经鉴定的胎牛血清</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td>75 mL</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺溶液</td><td>SIGMA</td><td>G7513</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>小鼠重组白血病抑制因子（LIF），0.5 × 10⁶ U/mL</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>CS210511</td><td>500 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>MEK/GSK3抑制剂补充剂</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>CS210510-500UL</td><td>500 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>ES细胞培养基储存时间不应超过4周，含抑制剂的培养基不应超过2周。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;mES细胞冻存培养基（配制50 mL完全溶液）&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;体积&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>SIGMA</td><td>D2650</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>DMEM高糖培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose）</td><td>SIGMA</td><td>D6429</td><td>24.9 mL</td></tr><tr><td>经鉴定的胎牛血清</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>小鼠重组白血病抑制因子（LIF），0.5 × 10⁶ U/mL</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>CS210511</td><td>50 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>材料/设备名称</td><td>公司</td><td>货号</td><td>RRID</td></tr><tr><td>0.05%胰蛋白酶/0.53 mM EDTA</td><td>CORNING</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>4%多聚甲醛</td><td>Thermo scientific</td><td>J19943-k2</td><td></td></tr><tr><td>Accutase溶液</td><td>SIGMA</td><td>A6964</td><td>细胞解离溶液</td></tr><tr><td>AgeI-HF</td><td>NEB</td><td>R3552L</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488标记的山羊抗小鼠抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A32723</td><td>AB_2633275</td></tr><tr><td>Alexa488标记的山羊抗兔抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A32731</td><td>AB_2633280</td></tr><tr><td>Alexa555标记的山羊抗兔抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A32732</td><td>AB_2633281</td></tr><tr><td>抗AFP抗体</td><td>Thermo scientific</td><td>RB-365-A1</td><td>AB_59574</td></tr><tr><td>抗-&amp;alpha;-平滑肌肌动蛋白（D4K9N）XP抗体</td><td>CST</td><td>19245S</td><td>AB_2734735</td></tr><tr><td>抗肌营养不良蛋白抗体</td><td>Thermo</td><td>PA5-32388</td><td>AB_2549858</td></tr><tr><td>抗LIN28A（D1A1A）XP抗体&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>CST</td><td>8641S</td><td>AB_10997528</td></tr><tr><td>抗MYH2抗体</td><td>DSHB</td><td>mAb2F7</td><td>AB_1157865</td></tr><tr><td>抗Nanog-XP抗体</td><td>CST</td><td>8822S</td><td>AB_11217637</td></tr><tr><td>抗Oct-4A（D6C8T）抗体</td><td>CST</td><td>83932S</td><td>AB_2721046</td></tr><tr><td>抗Sox2抗体</td><td>abcam</td><td>ab97959</td><td>AB_2341193</td></tr><tr><td>抗SSEA1（MC480）抗体&amp;nbsp;</td><td>CST</td><td>4744s</td><td>AB_1264258</td></tr><tr><td>抗TH（H-196）抗体</td><td>SANTA CRUZ&amp;nbsp;</td><td>sc-14007</td><td>AB_671397</td></tr><tr><td>碱性磷酸酶活细胞染色试剂（500倍浓缩）</td><td>Thermo</td><td>A14353</td><td></td></tr><tr><td>杀稻瘟菌素S（Blasticidin S）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203350</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI/Esp3I</td><td>NEB</td><td>R0580L/R0734L</td><td></td></tr><tr><td>羧苄青霉素</td><td>Millipore</td><td>205805-250MG</td><td></td></tr><tr><td>IV型胶原酶&amp;nbsp;</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004189</td><td></td></tr><tr><td>感受态细胞</td><td>TakaRa</td><td>636763</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS 2.0仙台病毒重编程试剂盒</td><td>Thermo</td><td>A16517</td><td></td></tr><tr><td>DirectPCR裂解试剂（细胞用）</td><td>VIAGEN BIOTECH</td><td>302-C</td><td></td></tr><tr><td>分散酶（1 U/mL）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>盐酸多西环素</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP26535</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101L</td><td></td></tr><tr><td>牛血浆纤维连接蛋白</td><td>SIGMA</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&lt;br/&gt; QIAEX II凝胶回收试剂盒（500）</td><td>QIAGEN</td><td>20051</td><td></td></tr><tr><td>猪皮来源A型明胶</td><td>SIGMA</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>含DAPI的HardSet抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素B（50 mg/mL）</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮注射液</td><td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH</td><td>45822</td><td></td></tr><tr><td>KpnI-HF</td><td>NEB</td><td>R3142L</td><td></td></tr><tr><td>lenti-CRISPRv2-blast</td><td>Addgene</td><td>83480</td><td></td></tr><tr><td>lenti-Guide-Hygro-iRFP670</td><td>Addgene</td><td>99377</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000转染试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>LV-TRE-VP64-小鼠MyoD-T2A-dsRedExpress2&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>60625</td><td></td></tr><tr><td>LV-TRE-VP16小鼠MyoD-T2A-dsRedExpress2</td><td>Addgene</td><td>60626</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗小鼠（M.O.M.）基础试剂盒</td><td>Vector</td><td>BMK-2202</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>NEB</td><td>R3189L</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I减血清培养基</td><td>ThermoFisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇4,000</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAA161510B</td><td></td></tr><tr><td>聚凝胺（Polybrene）</td><td>SIGMA</td><td>TR1003</td><td></td></tr><tr><td>Corning&amp;nbsp;BioCoat多聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白培养载玻片</td><td>CORNING</td><td>CB354688</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR Max Premix</td><td>TakaRa</td><td>R045</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>VIAGEN BIOTECH</td><td>507-PKP</td><td></td></tr><tr><td>盐酸嘌呤霉素</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN19453980</td><td></td></tr><tr><td>qPCR慢病毒滴度测定试剂盒</td><td>abm</td><td>LV900</td><td></td></tr><tr><td>快速连接试剂盒</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit（250）</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit（100）</td><td>QIAGEN</td><td>12945</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid RT反转录试剂盒</td><td>Thermo scientific</td><td>K1691</td><td></td></tr><tr><td>RNAzol RT</td><td>Molecular Research Center, INC</td><td>RN 190</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶反应缓冲液</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4多核苷酸激酶</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>改良优质肉汤（Terrific Broth Modified）</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP9729-600</td><td></td></tr><tr><td>ViralBoost试剂（500倍浓缩）</td><td>ALSTEM</td><td>VB100</td><td></td></tr></tbody></table>

利用crispr/cas9技术恢复ipsc来源的肌前体细胞中抗肌萎缩蛋白的表达

CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors

杜氏肌营养不良症（DMD）是一种由抗肌萎缩蛋白基因（dystrophin gene）突变引起的严重进行性肌肉疾病，最终导致肌肉前体细胞耗竭。成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9（CRISPR/Cas9）基因编辑技术有望恢复抗肌萎缩蛋白基因的表达。自体诱导多能干细胞（iPSCs）来源的肌肉前体细胞（MPC）可补充干细胞/前体细胞库，修复损伤，并在不引发免疫反应的情况下防止DMD进一步恶化。本研究中，我们介绍了一种结合CRISPR/Cas9与非整合型iPSC技术的方法，以获得抗肌萎缩蛋白表达恢复的肌肉前体细胞。简言之，我们利用非整合型仙台病毒载体，从Dmdmdx小鼠的皮肤成纤维细胞建立iPSC细胞系。随后采用CRISPR/Cas9缺失策略，通过非同源末端连接修复移码的抗肌萎缩蛋白基因，从而恢复其表达。在94个挑选出的iPSC克隆中，我们对三个克隆进行了PCR验证，确认其外显子23缺失。随后通过多西环素（Dox）诱导MyoD（一种在调控肌肉分化中起关键作用的转录因子）的表达，将iPSC分化为MPC。我们的结果表明，利用CRISPR/Cas9缺失策略恢复iPSC来源MPC中抗肌萎缩蛋白的表达是可行的，该方法在开发未来DMD治疗策略方面具有重要意义。

Dmdmdx 皮肤成纤维细胞来源的诱导多能干细胞的建立。 我们展示了利用无整合重编程载体从小鼠 Dmdmdx 模型来源的皮肤成纤维细胞高效生成诱导多能干细胞（iPSC）的方法。图1A 显示，感染后三周出现类似胚胎干细胞（ESC）的克隆集落。我们通过活细胞碱性磷酸酶（AP）染色评估iPSC诱导效率；图1B 显示，流式细胞术（FACS）分析表明AP阳性细胞比例约为1.8%。免疫荧光染色结果显示，iPSC克隆表达小鼠胚胎干细胞的多能性标志物SSEA1、Lin28、Nanog、OCT4和SOX2（图1C）。为研究iPSC在体内的三胚层分化能力，我们将iPSC直接注射至小鼠腓肠肌中。观察发现，注射的iPSC分化为肝细胞（内胚层）、平滑肌细胞（中胚层）和肾上腺素能神经元细胞（外胚层）（图1D），表明其具有多能性。</p...

本文介绍了一种基于Cas9的外显子23缺失方案，用于在源自Dmdmdx小鼠皮肤成纤维细胞的诱导多能干细胞（iPSC）中恢复抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的表达，并利用Tet-on MyoD激活系统将iPSC直接分化为成肌祖细胞（MPC）。

利用CRISPR/Cas9技术恢复iPSC来源的肌前体细胞中抗肌萎缩蛋白的表达

杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）是一种严重的进行性肌肉疾病，由抗肌萎缩蛋白基因（dystrophin gene）突变引起，最终导致……

杜氏肌营养不良症是一种导致肌肉前体细胞过早耗竭的肌肉营养不良症，属于最严重的肌营养不良症之一。为了促进功能性肌肉再生，我们采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，在诱导多能干细胞来源的肌肉前体细胞中恢复抗肌萎缩蛋白的表达。CRISPR-Cas9 基因编辑技术有望恢复抗肌萎缩蛋白基因的表达。自体诱导多能干细胞（iPSC）来源的肌肉前体细胞可补充干细胞库，修复损伤，并防止杜氏肌营养不良症（DMD）进一步发生并发症，且不会引发免疫反应。将诱导多能干细胞（iPS细胞）向成肌前体细胞分化的不同方法降低了iPS细胞肿瘤再发的风险。多种将自体诱导多能干细胞来源的肌前体细胞与CRISPR-Cas9介导的基因校正相结合的疗法，是治疗杜氏肌营养不良症的有前景策略。该技术可通过基因编辑自体干细胞，用于治疗多种先天性疾病，包括心脏、脑部和血液疾病。我们对此方法的演示可为读者提供细胞重编程和基因编辑的操作经验，而这些操作目前仍具挑战性。在倒置显微镜下观察感染的小鼠胚胎干细胞克隆。用自印式标记笔在培养皿底部标记克隆位置。将涂有油脂的克隆环覆盖在已标记的细胞克隆上。向每个克隆环中加入 100 微升 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，将培养板置于 37 摄氏度的培养箱中孵育 5 分钟。然后，用 100 微升移液器吸头将消化后的细胞转移至含有 250 毫升 MES 生长培养基的 48 孔培养板中。将细胞置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳和 85% 湿度的培养箱中孵育。当细胞生长至70%融合时，挑选细胞生长良好的孔，加入250毫升TVP溶液消化30分钟。随后，将每孔中的细胞培养物转移至六厘米培养皿中。重复使用克隆环并进行多次培养，直至获得形态均一、呈圆顶状的克隆。现在，通过加入一毫升 TVP 溶液消化制备好的小鼠诱导多能干细胞。将细胞培养物转移至经纤维连接蛋白和明胶包被的24孔板中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养。当细胞达到50%融合度时，更换为含有8微克/毫升Polybrene的新鲜培养基500微升。然后，向小鼠诱导多能干细胞（iPSCs）中加入100微升慢病毒颗粒溶液。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育三天。接着，确定在24小时内达到半数杀伤率所需的Blasticidin和Hygromycin B的最低浓度。向细胞中加入含有 2.5 微克/毫升杀稻瘟菌素（Blasticidin）和 100 微克/毫升潮霉素 B（Hygromycin B）的培养基，培养三天后，选择仍保持贴壁的细胞作为稳定感染的细胞。用 0.5 毫升 TVP 溶液消化所选的小鼠诱导多能干细胞（iPSCs），每孔接种至新的 24 孔板中，在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 30 分钟。随后，将 iPSCs 吹打成单细胞悬液，并使用细胞计数板进行细胞计数。挑选约150个已消化的单细胞，用MES培养基稀释后接种至10厘米培养皿中，在37°C、5% CO₂条件下培养。约10天后，在倒置显微镜下使用10微升无菌移液器吸头挑取单克隆，将每个克隆转移至96孔板中含50微升TVP溶液的孔内。在37°C下消化30分钟。可靠的徒手克隆挑选对于收获经 CRISPR/Cas9 编辑的诱导多能干细胞的成功至关重要。随后，将每个孔中消化后的细胞转移并分装至另外两个 96 孔培养板中。在 37 °C 下孵育，直至细胞融合度达到 70%。当细胞集落达到70%融合度时，移除96孔板中的培养基。向每孔加入含1%蛋白酶K溶液的25微升裂解试剂，并将裂解液转移至另一96孔PCR板中。用粘性封膜密封PCR板，置于PCR仪中55摄氏度孵育30分钟，随后95摄氏度孵育45分钟，以裂解细胞并灭活蛋白酶K。然后，在PCR管中加入2微升裂解液、10微升2×DNA聚合酶预混液、7微升无DNase水和1微升DMD外显子23引物。根据手稿说明开始PCR反应。然后，将含有2.2微升上样缓冲液的PCR反应产物上样至2%琼脂糖凝胶中。以100至150伏电压电泳30分钟，并在紫外光下观察凝胶。在本方案中，设计了两个位于突变外显子23两侧的向导RNA。在Cas9介导产生双链断裂并经非同源末端连接修复后，突变的外显子23被删除，从而允许产生截短但具有功能的抗肌萎缩蛋白。为避免胰蛋白酶溶液泄漏，需将润滑脂均匀涂抹在环状物底部。将CRISPR/Cas9基因编辑技术与附加的MyoD激活系统相结合，为杜氏肌营养不良症患者中具有基因修复能力的基础前体细胞进行自体移植提供了一种安全、可行且有效的策略。

crisprcas9-technology-restoring-dystrophin-expression-ipsc-derived

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

CRISPR/Cas9在iPSC衍生肌肉预祖中恢复肌营养不良素表达的技术

由诱导性多能干细胞（iPSC）衍生的成肌祖细胞是治疗肌肉营养不良症的细胞治疗策略中颇具前景的候选细胞。本方案描述了在急性与慢性肌肉再生小鼠模型中，评估iPSC来源的血管壁干细胞（一类肌肉祖细胞）移植后植入与分化能力所需的移植操作及功能检测方法。...

诱导多能干细胞来源的类血管壁细胞样肌源性前体细胞在小鼠肌肉再生模型中的移植

本方案包含从肌营养不良症患者尿液中分离尿源细胞的详细步骤，以及通过仙台病毒转导实现这些细胞高效快速重编程的方法。...

由肌营养不良症患者尿源性细胞高效无整合重编程生成诱导性多能干细胞

本文描述了利用iCRISPR平台生成人多能干细胞（hPSC）突变细胞系以及将hPSC分化为葡萄糖响应性β样细胞的实验方案。将基因组编辑技术与hPSC定向分化相结合，为系统分析谱系决定因子在人类发育和疾病进展中的作用提供了强有力的平台。...

利用基因组编辑和hPSC定向分化探究人类胰腺发育中的谱系决定因子

本方案详细描述了在无饲养层条件下，从人胰腺细胞生成无足迹诱导多能干细胞（iPSCs）的过程，随后利用CRISPR/Cas9核糖核蛋白进行基因编辑，并对经修饰的单细胞克隆进行表征分析。...

利用CRISPR-Cas9系统高效生成和编辑人胰腺细胞来源的无饲养层iPSCs

在此，我们提供了一项详细的实验方案，用于执行 体内...

腺相关病毒介导的 CRISPR 心脏基因编辑在小鼠中的应用

靶向DNA表观基因组编辑是一种强大的治疗策略。本方案描述了用于人诱导性多能干细胞（hiPSC）来源神经元表观基因组编辑的、携带CRISPR-dCas9-DNMT3A转基因的一体化慢病毒载体的制备、纯化与浓缩过程。...

用于高效递送表观基因组编辑工具至人诱导性多能干细胞衍生疾病模型的慢病毒载体平台

本文介绍了一种通过移植来源于正常肌源性前体细胞的外泌体， transiently...

纯化并移植源自成肌祖细胞的外泌体以改善杜氏肌营养不良小鼠的心脏功能

本文介绍了一种利用基于piggyBac的供体质粒和Cas9切口酶突变体，在人类多能干细胞中实现无缝基因编辑的详细方法。在人类胚胎干细胞（hESCs）中，将两个点突变引入肝细胞核因子4α（HNF4α）基因座的第8号外显子。...

利用无缝基因组编辑技术在人类多能干细胞中引入点突变

本方案描述了将皮肤成纤维细胞转化为成肌细胞，并进一步分化为肌管细胞的过程。这些细胞系来源于患有神经肌肉疾病的患者，可用于研究病理机制以及测试治疗策略。...

直接重编程人类成纤维细胞为成肌细胞以研究神经肌肉疾病疗法

本方案介绍了如何从设计向导RNA开始，到细胞克隆及基因敲除克隆的鉴定，利用CRISPR/Cas9技术生成敲除型成肌细胞。...

利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建基因敲除肌肉细胞系

本方法描述了利用高效慢病毒介导的基因递送系统，在稳定表达靶向L2HGDH基因的sgRNA的人胚胎干细胞（hESC）系H9中，构建CRISPR介导的基因敲除。...

CRISPR-Cas9 介导的无饲养层培养条件下人多能干细胞基因敲除

了解CRISPR/Cas9基因编辑技术在iPSC衍生肌肉预祖细胞中恢复肌营养不良素表达的方法。该技术通过Tet-on MyoD系统诱导分化，为杜氏肌营养不良症提供自体细胞治疗新策略。

利用CRISPR/Cas9技术恢复iPSC来源的肌前体细胞中抗肌萎缩蛋白的表达

探索更多视频