Name: 微电极阵列记录中天节点发射率，以识别小鼠内在心脏起搏缺陷 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学习使用微电极阵列记录小鼠窦房结组织，以测量内在心脏起搏发放率并识别起搏缺陷。该方法无需复杂电生理训练即可获取准确数据，适用于药理学效应研究。

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本工作由美国国立卫生研究院资助，资助编号为 R01NS100954 和 R01NS099188。

此处所述的所有实验操作均按照美国国立卫生研究院（NIH）的指南进行，并经南卫理公会大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
1. 用于记录的多电极阵列（MEA）包被
<ol>
	<li>配制 25 mM 硼酸盐缓冲液。
	<ol>
		<li>将 0.953 g 的 Na2B4O7·10 H2O 溶解于 80 mL 蒸馏水中。</li>
		<li>用 HCl 调节 pH 至 8.4，然后用蒸馏水定容至 100 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 0.1% 的聚乙烯亚胺（PEI）储备液。
	<ol>
		<li>将 100 µL 的 50%（w/v）PEI 加入 4.9 mL 蒸馏水中，配制成 1% 的 PEI 溶液。</li>
		<li>取 1 mL 的 1% PEI 溶液加入 9 mL 的 25 mM 硼酸盐缓冲液中，稀释成 0.1% 的 PEI 溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用移液器将约 1 mL 的 0.1% PEI 溶液加入微电极阵列（MEA）培养皿中，确保电极完全被覆盖（图 1A 和 1B）。 
	注：MEA 的微电极通常由铂黑或碳纳米管制成，并以聚酰亚胺（或丙烯酸）绝缘；这两种材料均具有疏水性。通过在 MEA 表面涂覆聚乙烯亚胺（PEI）等阳离子聚合物，可使疏水的 MEA 表面更亲水，从而促进组织样本与 MEA 表面更好地接触（图 1A1）。</li>
	<li>用热塑性薄膜覆盖 MEA 培养皿以减少蒸发，并在室温下静置过夜（图 1C）。</li>
	<li>用移液器吸除 MEA 培养皿中的 PEI 溶液，注意避免触碰电极网格以免损坏电极，随后用蒸馏水冲洗至少 4 次（图 1D）。</li>
	<li>将涂覆 PEI 的 MEA 保存在 1–2 mL 超纯水中，并用热塑性薄膜密封后置于 4 °C 保存，待用时取出。或者，也可将涂覆后的 MEA 浸没于盛有超纯水的烧杯中保存（图 1E）。 
	注：MEA 在首次使用前仅需进行一次 PEI 涂覆处理；每次记录实验后，应将 MEA 浸没于超纯水中保存。</li>
</ol>
2. 准备用于组织解剖的完全 Tyrode 溶液
<ol>
	<li>配制1,000 mL用于解剖的完全Tyrode's溶液；首先，将8.1816 g NaCl加入800 mL超纯水中。</li>
	<li>向溶液中加入以下量的化学试剂：0.4025 g KCl；0.1633 g KH2PO4；1.1915 g HEPES；0.9999 g葡萄糖；0.0952 g MgCl2；0.2646 g CaCl2·2H2O。</li>
	<li>用NaOH将pH值调节至7.4，然后加入超纯水至总体积为1,000 mL。 
	注意：完全Tyrode's溶液的最终成分为（单位为mM）：140 NaCl，5.4 KCl，1.2 KH2PO4，5 HEPES，5.55葡萄糖，1 MgCl2，1.8 CaCl2。</li>
</ol>
3. 准备用于记录的含氧台氏液
<ol>
	<li>配制 500 mL 台氏液；将 4.003 g NaCl 加入 400 mL 超纯水中。</li>
	<li>向溶液中加入以下量的化学试剂：0.651 g NaHCO3；0.042 g NaH2PO4；0.132 g CaCl2·2H2O；0.149 g KCl；0.0476 g MgCl2；0.999 g 葡萄糖。</li>
	<li>用 HCl 将 pH 值调节至 7.4，然后加入超纯水至总体积为 500 mL。</li>
	<li>在开始记录前，于室温下用碳氧混合气（carbogen）对溶液充氧至少 30 分钟。 
	&#8203;注意：台氏液的最终成分为（单位为 mM）：137 NaCl、15.5 NaHCO3、0.7 NaH2PO4、1.8 CaCl2、4 KCl、1 MgCl2、11.1 葡萄糖。该台氏液的成分与用于解剖的完全台氏液略有不同。</li>
</ol>
4. 准备用于药理学调节的4-氨基吡啶（4-AP）溶液
<ol>
	<li>配制4-AP的1 mM工作液：将18.82 mg的4-AP加入步骤3中制备的200 mL Tyrode's溶液中。</li>
	<li>实验前至少对4-AP溶液进行30分钟的充氧处理。</li>
</ol>
5. 准备受精卵培养皿以进行解剖
<ol>
	<li>按10:1的质量比将硅胶弹性体的基础剂与固化剂混合。</li>
	<li>将约15 mL硅胶弹性体混合物倒入直径为60 mm的培养皿中。</li>
	<li>在使用前于室温下静置固化48小时。 
	&#8203;注意：硅化处理后的培养皿可重复用于后续解剖操作。</li>
</ol>
6. 窦房结（SAN）的解剖
<ol>
	<li>准备用于窦房结（SAN）分离的肝素化完全台氏液。
	<ol>
		<li>将 400 µL 肝素（1,000 USP/mL）加入 40 mL 完全台氏液中，并在 37 °C 水浴中预热。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过腹腔注射向小鼠注射 200–300 μL 肝素（1000 USP/mL），并让动物静置 10 分钟。</li>
	<li>通过过量异氟烷实施安乐死。
	<ol>
		<li>将小鼠放入一个小型玻璃容器中，容器内含有由将 200–300 μL 液态异氟烷滴加至穿孔塑料管内的滤纸上所产生的异氟烷蒸气。 
		注意：由于异氟烷可能引起皮肤刺激并可通过皮肤吸收，因此液体不应直接接触小鼠。因此，浸有异氟烷的擦拭物应置于穿孔管中进行给药。</li>
		<li>通过观察运动和呼吸停止以及脚趾夹捏反射消失来确认死亡。通常在放入容器后约 1–2 分钟内死亡。 
		注意：死亡通常伴随排尿。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将小鼠仰卧固定于解剖板上，四肢伸展，并使用长度为 1 英寸、23 号规格的注射针将四肢固定在板上。然后使用手术剪刀剪除肋骨下缘附近的毛发，从毛根处剪除。 
	注意：解剖板可使用聚苯乙烯保温箱盖。</li>
	<li>用止血钳夹住皮肤，使用手术剪刀在肋骨下缘稍下方的皮肤上做一横向切口，从左侧肋弓至右侧肋弓（图 3A）。</li>
	<li>用手术剪刀切开腹膜，并小心将肝脏与膈肌分离，注意避免划伤肝脏，以免引起大量出血（图 3B）。沿胸廓切开膈肌以暴露胸腔（图 3C-D）。</li>
	<li>使用手术剪刀从肋弓边缘沿肋骨侧壁向上剪至锁骨，以暴露心脏，注意避免损伤心脏（图 3D）。然后使用 23 号注射针将肋骨固定于肩部上方，使其保持位置并远离手术区域。</li>
	<li>使用移液管滴加温热（37 °C）的肝素化完全台氏液至心脏表面，以保持其湿润。 
	注意：切勿让心脏干燥。</li>
	<li>用超细格拉费镊子夹住肺部，用手术剪刀切断气管以移除肺（图 3E）。</li>
	<li>用超细格拉费镊子夹住心脏心尖部，用手术剪刀剪断主动脉和&#160;腔静脉以将其移除。将心脏转移至含有固化硅橡胶的培养皿中（图 4A），并用移液管加入 2–3 mL 温热（37 °C）的肝素化完全台氏液冲洗心脏。 
	注意：注意避免损伤右心房后壁，该区域较薄且含有窦房结（SAN），以及相连的右心房静脉。用完全台氏液冲洗心脏可防止其干燥，但切勿将心脏完全浸没于溶液中，以免影响解剖过程中的视野。</li>
	<li>将心脏定向，使右心房位于实验者右侧，左心房位于实验者左侧。 
	注意：应尽快完成窦房结（SAN）组织的解剖，以防止缺血相关损伤。</li>
	<li>用解剖针将心脏心尖部固定于培养皿中。然后，用 Dumont #2 脊髓剥离镊子夹住下腔静脉，将 22 G 注射针穿过下腔静脉和上腔静脉，以确定其在右心房中的位置，从而大致定位窦房结（SAN）的位置（位于上腔静脉与下腔静脉之间的组织区域）（图 4B）。</li>
	<li>使用小型解剖针将左、右心耳固定于培养皿中。
	<ol>
		<li>用 Dumont #2 脊髓剥离镊子夹住左心耳，插入一根解剖针穿过左心耳以固定其位置。</li>
		<li>用 Dumont #55 镊子夹住右心耳，插入一根解剖针穿过右心耳以固定其位置。 
		注意：如需要，也可使用同种类型的镊子夹持左、右心耳。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移除穿过腔静脉的注射针。</li>
	<li>为排出心脏内血液，使用卡斯特罗维霍剪刀在心室水平做横向切口，切除心尖部（即下半部分）（图 4C）。然后用移液管加入温热（37 °C）的肝素化完全台氏液冲洗心脏。</li>
	<li>使用卡斯特罗维霍剪刀沿房室间隔进行剪切，切口应更靠近心室而非心房。继续沿房室间隔剪切，直至心房与心室完全分离。</li>
	<li>沿房间隔剪切以移除左心房。</li>
	<li>在右心房周围插入解剖针，使其展平（图 4D）。使用卡斯特罗维霍剪刀清除心房上残留的脂肪、血管或其他组织。</li>
	<li>在右心房中定位窦房结（SAN），在此方位下，其大致边界为上方的上腔静脉、下方的下腔静脉以及左侧的界嵴（图 4D）。 
	&#8203;注意：界嵴表现为右心耳与窦房结之间的一条深色肌性隆起。通常还可观察到窦房结动脉穿行于窦房结组织中（图 4D）。</li>
</ol>
7. 准备用于记录的MEA系统
<ol>
	<li>将步骤3中的Tyrode溶液加入输入液瓶（图5C），并通过开启系统中的碳氧混合气体（carbogen）气流（图5A）对溶液进行氧合。 
	注意：用于记录的Tyrode溶液在成分上与用于解剖的完全Tyrode溶液略有不同。</li>
	<li>通过观察锥形瓶中是否有气泡产生来确认碳氧混合气体的流动情况，该锥形瓶用于湿润气体（图5B），同时观察输入液瓶（图5C）中的气泡情况。</li>
	<li>将蠕动泵的进液管路（图5D）插入Tyrode记录溶液中（图5C），然后将蠕动泵的出液管路插入收集瓶中（图5I）。</li>
	<li>将蠕动泵设定为25 rpm，此时流速为2 mL/min，并启动泵。检查系统是否存在缓冲液泄漏或溢出情况。</li>
	<li>将温度控制器设定为37 °C，即小鼠的生理温度（图5E）。</li>
</ol>
8. 将心脏组织放置在MEA网格上
<ol>
	<li>借助画笔将分离的窦房结组织转移图6A) 从解剖用培养皿转移至MEA网格（图1A1).
	<ol>
		<li>在倒置显微镜下观察，用软毛刷轻轻移动组织，使窦房结区域覆盖在电极网格上。</li>
		<li>根据需要重新调整组织位置，以确保其平整地贴附在电极网格上，并与电极良好接触。 
		注意：转移组织时需使用软毛画笔，以避免损坏电极网格。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织正确放置后，使用骨科镊子（或任何弯头镊子）将补片置于组织上方（图6A）然后使用骨钳放置竖琴锚（图 6A) 在网片上以固定所有部件图6B).</li>
	<li>拍摄组织在MEA上的位置图像，以便在记录过程中将各个电极的活动与其解剖位置相对应。可通过将智能手机对准倒置显微镜的物镜，或使用连接的显微镜相机完成此操作。 
	注意：如果在拍摄图像后未改变MEA的方向，则在记录过程中，左上角的电极将显示为第一个通道（Ch1）。</li>
	<li>将MEA培养皿放置在连接板上（图5F 和6C）并小心地放置灌注帽（图6C) 放置在MEA培养皿上，同时不扰动harp切片锚定装置。可使用一小块实验室胶带进一步固定灌流盖。图6C). 
	注意：除了具有可调节的溶液流入和流出管道外，盖子还设有用于输送气体的接口图6C）。此外，参比电极环穿过帽盖（图6C).</li>
	<li>让组织在记录前从操作中恢复，并在灌流槽中适应环境15-20分钟。</li>
</ol>
9. 设置数据采集协议以进行记录
注意：以下步骤描述了如何打开用于自发搏动记录的软件程序并定义记录条件。这些步骤的具体操作可能因所使用的特定软件而异，但总体流程应保持一致。
<ol>
	<li>打开放大器（图5G），并在计算机软件中设置记录的工作流程（图5H）。
	<ol>
		<li>启动软件，点击工作流程。</li>
		<li>选择打开新文件夹。</li>
		<li>打开从模板文件夹。</li>
		<li>选择64MD1-1920X1080（根据您桌面的分辨率而定）。</li>
		<li>打开QT 文件夹。</li>
		<li>打开自发记录文件夹。</li>
		<li>选择Beat_recording.moflo模板并打开（图7A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据所需的记录条件设置记录参数，包括扫描次数、扫描持续时间、扫描间隔、输入电压、采样率等（图7B）。 
	注意：对于搏动频率和峰间数据采集，通常使用2.9 mV的输入范围电压、1 Hz高通滤波器、1000 Hz低通滤波器以及20 kHz的采样率。</li>
	<li>为了标记实验的不同阶段或条件（例如给药前和给药后），请点击注释选项卡以添加所需的标注（图7C）。</li>
	<li>为指定所采集数据的文件保存位置，请选中启用存储复选框，并在文件名修饰符框中输入所需的文件名。</li>
</ol>
10. 进行记录与数据采集
<ol>
	<li>点击采集软件最上方菜单栏中的记录与播放按钮以开始记录。以每分钟1次的时长采集10次记录，每次记录之间间隔2分钟。</li>
	<li>根据这些初始记录，通过确认大多数记录通道的信号幅度≥ 0.5 mV且峰间间隔一致，来验证所记录的波形是否符合健康且高质量组织制备的标准（图8）。 
	注意：可通过参考将组织放置于MEA后获取的图像，对各个微电极记录到的活动和波形与其解剖位置的对应关系进行初步评估。</li>
	<li>为测量药物对组织的影响，在采集完初始基线数据后，点击最上方菜单栏中的暂停按钮以暂停记录。 
	注意：可通过点击注释标签并按上述方法添加所需注释，在记录中标记实验的药物反应阶段（图7C）。</li>
	<li>暂停泵的运行，并将泵的进液管从正常的记录液切换至含有目标药物的Tyrode's溶液。 
	注意：在本示例实验中，使用的是含1 mM 4-氨基吡啶（4-AP）的Tyrode's溶液。</li>
	<li>重新启动泵，并取消暂停记录，继续采集数据。</li>
	<li>当含药物的Tyrode's溶液到达组织后，以与基线记录相同的方式再记录10次轨迹。 
	注意：随着药物进入记录腔室，记录信号需要一定时间才能稳定。药物的作用机制也可能影响记录的稳定性。对于具有可逆作用机制的药物，应记录洗脱期，以确认活动恢复至基线水平，这是组织健康状态的一个指标。</li>
	<li>点击停止以结束记录。</li>
	<li>在显微镜下对组织在MEA上的最终位置拍摄一张照片，以防组织在初始记录设置后发生位移。</li>
</ol>
11. 记录完成后清理装置
<ol>
	<li>清洁MEA。
	<ol>
		<li>记录结束后，使用1 mL移液器轻轻从MEA培养皿中移除记录溶液。 
		注意：务必小心，避免触碰MEA电极，以免造成损坏。</li>
		<li>使用骨科镊子（或任何弯头镊子）移除网格和Harp固定器。然后使用画笔轻轻将组织从MEA表面分离，操作过程中始终注意不要触碰单个微电极。</li>
		<li>使用洗瓶，用超纯水轻轻冲洗MEA培养皿约3至4次。</li>
		<li>将清洁后的MEA浸没于超纯水中，并在4 °C下保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过蠕动泵以最大速度设置运行超纯水至少5分钟，以冲洗系统管路。 
	&#8203;注意：为防止真菌生长，清洁后管路内不得残留任何水或缓冲液。</li>
</ol>
12. 分析MEA记录以测量窦房结搏动频率
<ol>
	<li>在分析软件的 &#34;Beat_frequency_analysis&#34; 模板中打开已保存的记录数据文件（图9）。</li>
	<li>点击 播放 按钮，运行整个记录过程，以可视化数据集并设定合适的分析参数。
	<ol>
		<li>为数据选择所需的显示格式的分箱窗口，即按每条轨迹平均或按时间平均（图10A）。</li>
		<li>选择要包含在分析中的通道，并设置期望的波形峰值自动识别的振幅最大值或最小值阈值（图10B）。 
		注意：在此步骤中可选择单个通道、多个通道组合或全部64个通道进行分析（图9）。如果所选阈值过于接近波形的最大值和最小值，分析软件可能无法识别部分波形峰值。</li>
		<li>设置分析中包含的峰前和峰后时间长度。 
		注意：通常设置峰前50 ms和峰后100 ms效果较好（图10B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设定分析条件后，再次点击播放按钮重新运行数据集，确认分析参数适用于峰电位提取。</li>
	<li>进行分析时，识别在实验基线期大多数通道中表现出稳定搏动频率的三个最稳定的连续轨迹，以及在药物暴露期另外三个连续的稳定轨迹（图10A）。</li>
	<li>指定用于分析的起始和终止轨迹，并输入每条待分析轨迹的时间持续长度（图9）。</li>
	<li>开始分析前，勾选 保存每分钟搏动次数 和 保存峰间间隔 的启用框（图10B）。</li>
	<li>在 文件名修饰符 框中输入期望的文件名（图10B）。搏动频率和峰间间隔的分析数据将以ASCII（文本）格式保存。 
	注意：若要分析不同条件（如基线和药物反应），必须分别为每种条件单独运行分析。</li>
	<li>点击顶部选项卡栏上的 播放并记录 按钮以开始分析。</li>
	<li>若要将数据导出用于其他应用程序，请勾选 保存每分钟搏动次数 和 保存峰间间隔 的选项框（图10B）。在 文件名修饰符 框中输入期望的文件名（图10B），然后点击 保存 ，将分析后的数据以ASCII文本格式保存至所选文件夹中。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

练习并熟练掌握窦房结（SAN）的分离过程至关重要，因为该组织较为脆弱，且需要保持组织健康才能成功记录。在窦房结分离过程中，正确的方位判断对于获取合适的组织区域极为关键。然而，在解剖过程中心脏原有的方位很容易丢失，这给操作带来困难。因此，为确保正确的左右方位，应通过肉眼观察心房结构进行判断。通常情况下，右心房较为透明，而左心房颜色较深，呈较暗的红色25,48。此外，在操作或将其固定于电极阵列上时，切勿拉伸窦房结组织，因为该组织极易受到机械损伤51。一个判断窦房结组织是否健康且分离得当的小技巧是：将组织置于完全Tyrode溶液中，在显微镜下观察其是否具有搏动。一旦技术掌握熟练，至少90%的组织制备样本应可用于记录。
有几点注意事项可提高成功记录及后续数据分析的可能性。为确保最佳记录效果，应在正式实验记录前仔细配制并测试溶液，并先在练习用小鼠样本上进行验证。我们经过大量工作对记录溶液进行了调整和优化，以维持窦房结（SAN）组...

心脏是一个复杂的器官，其功能受心脏内在因素和外在因素（如源自大脑的影响）共同调控。窦房结（SAN）是心脏中一个特定区域，包含起搏细胞（也称为窦房细胞或SA细胞），负责启动和维持哺乳动物的心跳1,2。固有心率是指仅由起搏细胞驱动、不受其他心脏因素或神经-体液影响的心率；然而，临床上对人类和活体动物心率的传统测量方法（如心电图）所反映的是起搏细胞活动与神经影响共同作用的结果。其中，对SA细胞最显著的神经影响来自自主神经系统，该系统持续调节其放电模式以满足机体的生理需求3。支持这一观点的是，在窦房结附近可发现交感神经和副交感神经的投射纤维4。内在心脏神经系统（ICNS）是另一个重要的神经调控系统，其位于右心房的神经节丛可支配并调节窦房结的活动5,6。
理解起搏功能障碍在临床上具有重要意义，因为此类功能障碍可能构成多种心脏疾病的基础，并增加其他并发症的风险。病态窦房结综合征（SSS）是一类以窦房结功能障碍为特征的疾病，可阻碍正常的起搏功能7,8。SSS 的临床表现包括窦性心动过缓、窦性停搏、窦房结暂停、窦房传导阻滞，以及心动过缓与心动过速交替出现的心律失常9，可能导致栓塞性卒中和猝死风险增加等并发症8,10。患有Brugada综合征（一种以心室颤动为特征、猝死风险增加的心脏疾病）的患者，若同时合并窦房结功能障碍，则发生心律失常事件的风险更高11,12。窦房结功能障碍还可能对心脏以外的生理功能产生影响。例如，已有报道显示，SSS 可因脑灌注不足而在患者中诱发癫痫发作13。
为了识别窦房结起搏功能障碍，需要在不受自主神经系统或体液因素影响的情况下，通过测定窦房结（SAN）的活动来确定固有心率。临床上，可通过药物性自主神经阻断来近似实现这一目的14，而该技术同样可用于哺乳动物模型以研究心脏的固有功能15,16。尽管该方法可阻断大部分神经输入，实现对心脏的体内检查，但仍无法完全消除所有来自心脏外部的影响因素。另一种用于研究动物模型中心脏固有功能的研究技术是离体心脏记录，即采用Langendorff灌流心脏，通常结合心内电图、起搏刺激或心外膜多电极阵列进行测量17,18,19,20。虽然该技术通过将心脏从体内取出，更专注于心脏本身的功能，但其测量结果仍可能受到机械-电反馈自身调节机制的影响，从而干扰固有心率的测定21。此外，离体心脏记录仍可能受到内在心脏神经系统（ICNS）的自主调节影响5,6,22,23。同时，在离体心脏实验中，维持心脏处于生理相关的温度对于准确测量心脏功能至关重要，但实现这一点往往存在技术困难20。一种更为直接的研究窦房结功能的方法是特异性分离窦房结组织并测量其电活动。这可通过制备窦房结条（即分离的窦房结组织）或分离窦房结起搏细胞来实现24,25。这两种方法均需要高度的技术训练，因为窦房结是一个体积微小且结构高度特化的区域；而细胞分离的难度更高，若解离操作不当，可能导致细胞整体健康状态受损。此外，这些技术还要求研究人员具备专业的电生理技能，才能成功使用单个记录微电极对组织或细胞进行电生理记录。
在本方案中，我们描述了一种记录窦房结（SAN）活动的技术 体外 通过使用微电极阵列（MEA）获取固有心率测量值。该方法的优势在于，即使研究人员缺乏深入的电生理学技术背景，也能进行高特异性的电生理记录。此前，MEA 已被用于研究原代心肌细胞培养物中的心肌细胞功能26,27,28,29,30,31,32，心肌片33,34,35,36,37,38,39以及组织全 mount40,41,42,43,44,45,46,47先前的研究也已对窦房结组织中的场电位进行了考察41,42在此，我们提供一种利用多电极阵列（MEA）记录和分析小鼠固有窦房结（SAN）放电频率的方法。同时，我们还描述了如何应用该技术检测药物对窦房结固有放电频率的药理学影响，并通过一个示例实验展示电压门控钾通道阻滞剂4-氨基吡啶（4-AP）的作用效果。+ 通道阻滞剂。通过使用明确的解剖标志，我们能够准确记录窦房结（SAN）电活动，而无需像其他方法那样进行广泛的组织解剖或细胞分离。尽管多电极阵列（MEA）成本较高，但其记录结果可提供高度特异且可靠的起搏活动测量数据，适用于广泛的临床和生理学研究应用。

<table><tbody><tr><td>4-氨基吡啶</td><td>Sigma</td><td>A78403-25G</td><td></td></tr><tr><td>22 号注射器针头</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5A</td><td>用于解剖</td></tr><tr><td>23 号注射器针头</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-6C</td><td>用于解剖</td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-105G</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Pyrex 瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-414-1C</td><td>用于储存溶液</td></tr><tr><td>1000 mL Pyrex 瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-414-1D</td><td>用于储存溶液</td></tr><tr><td>骨钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>16060-11</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙二水合物 (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080-500G</td><td></td></tr><tr><td>碳酰气 (95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo 剪刀，4&quot;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>数据采集计算机</td><td></td><td></td><td>CPU：Intel Xeon 或 Intel Core i7，内存：8 GB，硬盘：1 TB，显卡：NVIDIA 或板载，屏幕：1920×1080</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Jenco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖针</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #2 椎板切除钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;超细 Graefe 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>玻璃腔室</td><td>Grainger</td><td>49WF30</td><td>用于小鼠安乐死</td></tr><tr><td>Harp 固定锚具套件</td><td>Warner Instruments</td><td>&amp;nbsp;SHD-22CL/15 WI 64-0247</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Chemicals</td><td>SA48-4</td><td>用于 pH 平衡</td></tr><tr><td>止血钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram</td><td>NDC 63739-953-25</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Motic</td><td>AE2000</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td></td></tr><tr><td>实验室封口膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-950</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜光源</td><td>Dolan-Jenner</td><td>MI150DG 660000391014</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁 (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208337-100G</td><td></td></tr><tr><td>MED64 头部放大器</td><td>MED64</td><td>MED-A64HE1S</td><td></td></tr><tr><td>MED64 主放大器</td><td>MED64</td><td>MED-A64MD1A</td><td></td></tr><tr><td>MED64 灌流帽</td><td>MED64</td><td>MED-KCAP01</td><td></td></tr><tr><td>MED64 灌流管支架套件</td><td>MED64</td><td>MED-KPK02</td><td></td></tr><tr><td>MED64 温控连接器</td><td>MED64</td><td>MED-CP04</td><td></td></tr><tr><td>网状支架</td><td>&amp;nbsp;Warner Instruments</td><td>640246</td><td></td></tr><tr><td>微电极阵列 (MEA)</td><td>Alpha Med Scientific</td><td>MED-R515A</td><td></td></tr><tr><td>Mobius 软件</td><td>WitWerx Inc.</td><td></td><td>MED64 专用软件</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Chemicals</td><td>S320-500</td><td>用于 pH 平衡</td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Ultigiene</td><td>NDC 50989-885-17</td><td></td></tr><tr><td>毛笔</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1751733</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Genesee Scientific</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Gilson</td><td>F155009</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-171-298</td><td>内径 1/8 英寸</td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺</td><td>Sigma</td><td>P3143</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾 (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾 (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655-500G</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 弹性体套件</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma</td><td>S6566</td><td></td></tr><tr><td>四硼酸钠</td><td>Sigma</td><td>S9640</td><td></td></tr><tr><td>手术剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14074-09</td><td></td></tr><tr><td>移液管 (3 mL 带刻度)</td><td>Samco Scientific</td><td>225</td><td></td></tr></tbody></table>

利用微电极阵列记录窦房结放电频率以鉴定小鼠固有心脏起搏功能缺陷

Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice

位于右心房的窦房结（SAN）含有心脏起搏细胞，该区域功能障碍可导致心动过速或心动过缓。可靠地识别心脏起搏功能缺陷需要通过最大限度地排除自主神经系统的影响来测量心脏的固有心率，因为自主神经系统可能掩盖心率异常。传统分析心脏固有起搏功能的方法包括使用药物诱导的自主神经阻断以测量体内心率、离体心脏记录以测量固有心率，以及窦房结条带或单个窦房结起搏细胞的膜片钳记录以测量自发动作电位发放频率。然而，这些传统技术在操作上具有较高的难度且实施困难。本文介绍一种新方法，即通过对小鼠完整窦房结组织进行微电极阵列（MEA）记录来测量心脏固有放电频率。MEA由多个微电极以网格状排列组成，用于记录体外细胞外场电位。本文所述方法相较于以往方法具有更快速、更简便且更精确的优点，同时便于进行药理学干预研究。

在组织于培养皿中适应15分钟后，记录10段持续一分钟的信号。我们目前的实验方案记录时长超过1小时，但在未展示的未发表数据中，我们已观察到持续≥4小时的稳定放电模式。如果实验制备状态良好，适合数据采集，则每个记录通道应表现出一致且等间距重复出现的、形态均匀的波形（即尖峰）（图11D）。这些波形对应于单个心跳事件，反映心脏固有的起搏活动。尽管各通道的波形形态应保持一致，但由于电极在组织中的位置相对于去极化起始点存在微小差异，不同通道之间的波形可能不会完全对齐，但各通道的尖峰间期应保持相同（图8）。然而，由于电极在组织中的位置不同，各通道之间的波形形态会有所差异（图8）。组织与电极之间的接触程度也可能影响波形特征，例如幅值。但如果制备状态良好，大多数通道的幅值峰值应至少达到0.5 mV。从记录的10段信号中，选择连续三个最符合上述质量标准的通道进行后续分析。图10A展示了三个连续通道的稳定搏动频率（上图）和...

本方案旨在介绍一种利用微电极阵列记录完整窦房结组织以测量内在心脏起搏频率的新方法，用于识别小鼠的起搏功能缺陷。该方法还可引入药理学试剂，以研究其对内在起搏活动的影响。

位于右心房的窦房结（SAN）含有心脏起搏细胞，该区域功能障碍可导致心动过速或……

测量固有心率是评估心脏健康的重要指标。该技术能够准确测量这一指标，同时排除大多数对窦房结的干扰因素。通过微电极阵列（MEA）记录固有心率，可获得与单细胞记录相似的精确放电率数据，且无需接受 extensive 的电生理学培训。初学者在使用该技术时，可能在早期实验中难以获得健康的组织样本，因此在开始正式数据采集之前，应先练习解剖操作，并优化缓冲液配方及数据采集参数。本实验操作将由本实验室的博士后研究人员 Man Si 博士和 Praveen Kumar 博士进行示范。首先用止血钳夹住已实施安乐死的小鼠皮肤，然后使用手术剪从左侧肋弓至右侧肋弓，在肋骨下缘稍下方的皮肤处做一个横向切口。使用手术剪切开腹膜，并小心地将肝脏从膈膜分离，避免划伤肝脏以防止大量出血。沿胸腔切开膈膜以暴露胸腔。使用手术剪从肋弓边缘向上至锁骨处剪开肋骨的侧壁，以暴露心脏，然后使用23号注射器针头将肋骨固定在肩部上方。使用移液管将温热的含肝素完全台氏液滴加到心脏上，以保持其湿润。用超细格拉夫镊子夹住肺部，用手术剪剪断气管以去除肺部。在取出心脏时，用超细格拉夫镊子夹住心脏心尖，用手术剪剪断主动脉和下腔静脉。将心脏转移至含有固化硅胶弹性体的培养皿中，并使用移液管向心脏灌注2至3毫升温热的含肝素完全台氏液。用解剖针将心脏心尖固定于培养皿上。用Dumont 2号椎板切除钳夹持下腔静脉。使用22号注射针头穿过下腔静脉和上腔静脉，以确定其在右心房的位置，从而间接标定窦房结的大致位置。用Dumont 2号椎板咬合钳夹住右心耳，并用解剖针穿过右心耳以固定其位置。对左心耳重复相同操作，随后移除贯穿腔静脉的注射针头。使用Castroviejo剪刀在心室水平进行横向剪切，切除心脏心尖以释放心脏内的血液，随后加入温热的含肝素完全Tyrode's溶液冲洗心脏。使用Castroviejo剪刀沿房室间隔剪切，直至将心房与心室分离，并使切口靠近心室侧。沿房间隔剪切以去除左心房。将解剖针插入右心房的周边，使其平铺展开。使用卡斯特罗维耶霍剪刀去除心房上残留的脂肪、血管或组织，并在右心房内定位窦房结。向灌注液模型中加入台氏液，并打开碳酰气（carbogen）气流以氧合台氏液。将蠕动泵设置为25 RPM，以获得每分钟2毫升的流速。启动泵后，确保缓冲液无泄漏，并将温度控制器设定为37摄氏度。使用Dumont 55镊子将解剖好的组织从解剖用培养皿转移至微电极阵列网格上。使用软毛画笔轻轻移动组织，使其覆盖电极网格的窦房结区域。然后用骨科镊子或任何弯曲镊子将网状结构放置在组织上。使用骨科镊子将竖琴锚固定在网格上，以确保所有部件位置固定。将微电极阵列培养皿放置在连接板上。小心地将灌流帽置于微电极阵列培养皿上，避免扰动网格切片固定锚，并用胶带固定灌流间隙。打开放大器，并在软件中设置记录的实验流程。选择 beat_recording.moflo 模板。打开后，根据所需的记录条件设置迹线数量、迹线持续时间、迹线间隔、输入电压、采样率及其他记录参数。点击记录和播放按钮，开始记录并采集10次轨迹数据，每次持续一分钟，轨迹之间间隔两分钟。暂停泵的运行，将泵的进液管从正常记录液切换到含有选定药物的台罗德溶液（Tyrode's solution）。重新启动泵并继续记录。当含药物的台氏液到达组织后，以与基线记录相同的方式记录10次信号。最后拍摄一张组织在微电极阵列上位置的照片。在分析软件的搏动频率分析模板中打开已保存的记录数据文件。单击播放按钮，运行整个记录以进行数据可视化，然后设置相应的分析参数。选择要包含在分析中的通道，并设定所需的振幅最大值或振幅最小值阈值，以实现对波形峰的自动识别。再次单击播放图标以重新运行数据集，确认分析参数适用于动作电位的提取。用于分析时，需在实验基线期，在大多数通道中识别出三个跳动频率最稳定的连续轨迹，另在药物暴露期再识别三个连续的稳定轨迹。点击播放和记录图标以开始分析。数据来自一只45日龄雄性野生型黑瑞士小鼠，用于窦房结搏动频率的测量。在不同通道中观察到具有不同形状和幅度的波形，所有通道均显示出相同的峰间间隔和放电频率。然而，组织与电极的接触程度也可能影响波形特征，例如幅度。从记录的10条轨迹中，选取了三个连续且具有稳定搏动频率和峰间间隔的通道用于进一步分析。异常提取的尖峰模式应当不存在，如果出现，则可能是受到噪声影响或不稳定所致。对应于单个心跳的波形反映了心脏固有的起搏活动。微电极阵列系统便于施加药物试剂，以分析其药理学效应。在所有64个通道中，所选三条轨迹的固有放电频率在采样数据中约为每分钟320次。如预期，加入4-氨基吡啶后，峰间间隔增加，使搏动频率从每分钟320次降低至每分钟210次。为收集可靠的分析数据，在记录过程中需确认组织处于健康状态，方法是验证轨迹稳定并符合标准判据。MEA可用于记录心脏其他区域的心脏活动，从而实现详细的区域特异性表征，便于研究遗传和药物干预的影响。

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微电极阵列记录中天节点发射率，以识别小鼠内在心脏起搏缺陷

程序性电刺激可用于评估心脏的传导特性，并通过不同的起搏方案诱导和终止心律失常。利用经静脉导管，在小鼠中实施程序性电刺激方案后，可获取心内电图记录，以识别致心律失常的基质。...

小鼠程序性电刺激

遥测心电图已成为评估动物心律失常和心脏性猝死模型的重要工具。本文提供了一套逐步操作指南，用于小鼠长期动态心电图监测中的遥测心电图记录。...

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本视频演示了从小鼠心脏中分离窦房结（SAN）的操作步骤。窦房结内含有窦房结细胞，可通过产生自发性动作电位来启动心跳。...

从小鼠模型中分离窦房结：一种从小鼠心脏获取窦房结的实验方法

本文演示了从小鼠成年个体中分离窦房结心肌细胞（SAMs）的方法，可用于膜片钳电生理学或成像研究。分离的细胞可直接使用，也可在培养中维持，以实现目的蛋白（如基因编码报告蛋白）的表达。...

从小鼠成年心脏窦房结分离、培养及功能表征心肌细胞的方法

本文介绍了一种以高空间和时间分辨率对小鼠右心房特别是窦房结的电活动进行光学标测的实验方案。...

小鼠窦房结的高分辨率光学标测

在此，我们描述了成年小鼠心室切片的制备方法及其在尖电极动作电位记录中的应用。这些多细胞制备物提供了结构完整的 体内 类似组织的结构，使其成为电生理学和药理学研究的有价值模型 体外.

用于电生理研究的小鼠短轴心室心脏切片

本方案描述了利用具有高时间分辨率和空间分辨率的光学标测系统对小鼠心房进行电生理学评估的方法，包括通过特制电极导管进行程序化刺激，同步记录膜电位和Ca2+瞬变信号。...

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心内神经元对心脏电生理学及心律失常发生的影响 离体 朗根多夫系统

我们介绍一种在小型小鼠中技术上简便、成本低廉、快速且经济的ECG检测方案，并可实现更高的检测灵敏度。我们建议将该方法作为研究小鼠中药物作用、基因修饰及疾病模型的筛选手段。...

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本文介绍了一种半自动分析小鼠长期心电图（ECG）数据的分步实验方案，用于获取基本 ECG 参数及常见心律失常的分析结果。数据通过植入式遥测发射器在清醒、自由活动的小鼠中采集，并使用 Ponemah...

分析长期心电图记录以检测小鼠心律失常

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优化经食管心房起搏评估小鼠心房颤动易感性

学习使用微电极阵列记录小鼠窦房结组织，以测量内在心脏起搏发放率并识别起搏缺陷。该方法无需复杂电生理训练即可获取准确数据，适用于药理学效应研究。

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