Name: CD光谱学研究DNA-蛋白质相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: 了解圆二色谱技术用于分析ATP依赖性染色质重塑蛋白诱导的DNA构象变化。该方法可高灵敏度检测DNA结构改变，为转录调控机制研究提供重要见解。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢贾瓦哈拉尔·尼赫鲁大学（JNU）先进仪器研究设施提供的圆二色光谱仪。V.J. 和 A.D. 获得了印度科学与工业研究理事会（CSIR）提供的奖学金支持。

1. 反应组分的工作浓度
<ol>
	<li>新鲜配制圆二色谱（CD）及其他反应组分所需的缓冲液工作浓度（参见表1），并在进行反应前将其保存于4 °C。 
	注意：本文所述CD反应中各组分的工作浓度如下：磷酸钠缓冲液（pH 7.0）1 mM、ATP 2 mM、DNA 500 nM、蛋白质 1 µM、MgCl2 10 mM、EDTA 50 mM、ADAADiN 5 µM。</li>
</ol>
2. ATP酶活性
<ol>
	<li>在进行圆二色光谱分析之前，需先检测蛋白质在不同DNA分子存在下的ATP酶活性，以确保用于圆二色光谱分析的蛋白质具有活性，并确定最能有效促进ATP水解的DNA分子。</li>
	<li>通过NADH偶联氧化法测定蛋白质在不同DNA分子存在下的ATP酶活性，该方法包含以下两个反应。
	<ol>
		<li>在96孔板中混合0.1 µM ADAAD、2 mM ATP、10 nM DNA和1x REG缓冲液，最终体积为250 µL。 
		注：丙酮酸激酶利用ADP和Pi将磷酸烯醇式丙酮酸转化为丙酮酸，从而再生ATP。这可确保反应体系中ATP始终处于饱和浓度。在第二个反应中，丙酮酸激酶作用生成的丙酮酸被乳酸脱氢酶转化为乳酸。在此过程中，一个NADH分子被氧化为NAD+。通过测定340 nm处的吸光度来检测NADH的消耗量。</li>
		<li>在37 °C孵育箱中孵育30分钟。</li>
		<li>使用酶标仪在340 nm处测定NAD+的生成量。</li>
		<li>使用酶标仪配套软件测定NAD+的含量。
		<ol>
			<li>点击NADH assay 以测定340 nm处的吸光度。</li>
			<li>将96孔板放置于仪器的板架上，点击Read Plate按钮记录吸光度。 
			注：NAD+的浓度通过NADH的摩尔消光系数6.3 mM−1，利用公式（1）计算得出。 
			A = εcl （1） 
			 
			其中，A = 吸光度 
			ε = 摩尔消光系数 
			c = 摩尔浓度 
			l = 光程长度（cm）</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 圆二色性比色皿的选择与准备
<ol>
	<li>使用高透明度石英比色皿采集圆二色光谱。可采用矩形或圆柱形比色皿。 
	注意：本文所述所有反应均使用同一种CD石英比色皿（标称体积为0.4 mL，光程为1 mm）。</li>
	<li>使用比色皿清洗液清洗比色皿。将1%的比色皿清洗液加入水中，配制成400 µL溶液，倒入比色皿中，并在37 °C下孵育1 h。</li>
	<li>用清水反复冲洗比色皿以彻底清洁。取水或缓冲液加入比色皿中进行扫描，检查其是否清洁。 
	注意：水或缓冲液的读数必须在0至1 mdeg范围内。</li>
</ol>
4. 蛋白质和DNA寡核苷酸的制备
<ol>
	<li>反应中蛋白体积应保持在 50 µL 以下，以减少缓冲液组分的用量，避免产生难以解析的杂峰。整个实验过程中应将蛋白置于冰上，防止降解。</li>
	<li>反应中使用经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化的 DNA 寡核苷酸。 
	注意：本实验中使用的 DNA 包括天然状态以及经过加热-冷却处理的形式（快速冷却（FC）和缓慢冷却（SC））。快速冷却促进 DNA 分子内键合，形成较多二级结构；而缓慢冷却则促进 DNA 分子间键合，导致较少的二级结构形成。</li>
	<li>快速冷却操作：将 DNA 在加热块上 94 °C 加热 3 分钟，立即置于冰上冷却。缓慢冷却操作：将 DNA 在 94 °C 加热 3 分钟后，以每分钟降低 1 °C 的速率冷却至室温。</li>
</ol>
5. 设置对照实验以记录基线光谱
<ol>
	<li>所有反应均保持 300 µL 的反应体积。在 1.5 mL 离心管中依次设置共 5 个基线反应：i) 缓冲液 + 水；ii) 缓冲液 + MgCl2 + ATP + 水；iii) 缓冲液 + MgCl2 + ATP + 蛋白质 + 水；iv) iii + EDTA 或 ADAADiN；v) 缓冲液 + 蛋白质 + 水。</li>
</ol>
6. 设置实验以记录圆二色光谱
<ol>
	<li>在1.5 mL离心管中依次设置总共5个反应，具体如下：i) 缓冲液 + DNA + 水；ii) 缓冲液 + DNA + MgCl2 + ATP + 水；iii) 缓冲液 + DNA + MgCl2 + ATP + 蛋白质 + 水；iv) iii + EDTA 或 ADAADiN；v) 缓冲液 + DNA + 蛋白质 + 水。</li>
</ol>
7. 记录扫描
<ol>
	<li>打开气体并启动圆二色光谱仪。</li>
	<li>10–15 分钟后打开光源。启动水浴，并将样品池温度设定为 37 °C。</li>
	<li>打开 CD spectrum 软件。
	<ol>
		<li>将温度设置为37 °C。</li>
		<li>将波长范围设置为180 – 300 nm。</li>
		<li>将每点积分时间设置为0.5 s。</li>
		<li>将扫描次数设置为5。</li>
		<li>点击Pro-Data Viewer，新建一个文件，并根据实验内容和日期重命名。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将所有反应组分置于冰上，以避免任何降解。在离心管中逐个配制基线样品和反应体系，并通过移液混匀。小心地将反应混合液转移至比色皿中，确保无气泡产生。</li>
	<li>若进行时间进程实验，将反应体系在 37 °C 下孵育所需时间后进行扫描。向含有 DNA、ATP、Mg+2 和蛋白质的缓冲液中加入 EDTA，以终止 ATP 水解。</li>
	<li>提高 EDTA 的浓度并延长其孵育时间，以完全抑制 ATP 酶活性。</li>
	<li>在软件中将相应反应的基线扣除（例如，从反应 1 中减去基线 1）。可在 CD 光谱软件或数据绘图软件中对数据进行平滑处理，并在数据绘图软件中绘制曲线。 
	注：从相应反应中扣除基线可获得仅来自 DNA 的净圆二色光谱。</li>
</ol>
8. 数据分析与解释
<ol>
	<li>使用公式 eq (2）将毫度单位测得的值转换为平均残基椭圆率。 
	<img alt="静力平衡公式 [θ]=(S×mRw)/(10cL)，用于科学分析的数学方程。" src="/files/ftp_upload/63147/63147eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1">  (2) 
	其中，S 表示以毫度为单位的 CD 信号，c 表示以 mg/mL 为单位的 DNA 浓度，mRw 表示平均残基质量，l 表示以 cm 为单位的光程长度。</li>
	<li>使用数据绘图软件，以波长为横坐标、平均残基椭圆率为纵坐标绘制图形，并分析峰形特征。</li>
	<li>绘制图形时，以Y轴表示平均残基椭圆率，X轴表示波长，绘制一条直线图。 
	注意：该图谱将提供不同构型DNA的特征峰，可通过查阅现有文献确定各峰所对应的DNA构型。6.</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文旨在介绍圆二色光谱技术作为一种研究方法，用于分析在依赖ATP的染色质重塑蛋白存在下DNA发生的构象变化，并将这些构象变化与基因表达关联起来。圆二色光谱技术为研究DNA的构象变化提供了一种快速且易于实施的方法。

该技术需要考虑的一个关键点是DNA和蛋白质的纯度。建议确保DNA和蛋白质的纯度均高于&#62;95%。实验中必须使用经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化的寡核苷酸，而蛋白质则最好通过亲和层析纯化至&#62;95%的纯度。另一个关键参数是比色皿必须清洁，使得基线读数不超过1 mdeg。缓冲液应使用高压灭菌水配制，且缓冲液本身的基线读数也不应超过1 mdeg。为了研究启动子的构象，必须确定蛋白质结合的区域。因此，建议使用目标蛋白质进行染色质免疫沉淀（ChIP）实验，因为该过程有助于鉴定效应基因启动子区域中被该蛋白质结合的DNA序列。一旦确定了结合区域，即可利用现有的生物信息学工具分析该序列形成特定结构的能力。这一点非常重要，因为ChIP引物通常长达200 bp，可能具有多种构象。因此，使用生物信息学工具识别结构有助于将寡核苷酸的长度缩短至仅包含一种结构的片段。...

圆二色性（CD）是一种光谱技术，依赖于生物大分子固有的手性，这种手性导致对右旋和左旋圆偏振光的吸收存在差异。这种吸收差异被称为圆二色性。因此，该技术可用于解析生物大分子（如蛋白质和DNA）的构象，这两种分子均含有手性中心1,2。
电磁波包含电场和磁场两个组分。电场和磁场均在垂直于波传播方向的平面内振荡。对于非偏振光，这些场在多个方向上振荡。当光为圆偏振光时，两个电磁场之间存在90°的相位差。手性分子表现出圆二色性（双折射），会不同程度地吸收右旋圆偏振光和左旋圆偏振光3。由此产生的电场轨迹呈椭圆形，且依赖于波长。因此，圆二色光谱以椭圆率（q）记录，数据以平均残基椭圆率对波长作图的形式呈现。
对于蛋白质而言，除甘氨酸外，氨基酸的Cα原子具有手性，这一特性被圆二色光谱（CD）用于测定该大分子的二级结构4。蛋白质分子的CD光谱通常在远紫外区记录。α-螺旋结构的蛋白质在222 nm和208 nm处有两个负峰，在193 nm处有一个正峰4。具有反平行β-折叠二级结构的蛋白质在218 nm处呈现一个负峰，在195 nm处有一个正峰4。结构无序的蛋白质在210 nm附近表现出较低的椭圆率，并在195 nm处有一个负峰4。因此，不同二级结构所对应的特征峰/谱带使得CD成为研究蛋白质在变性过程及配体结合过程中二级结构发生构象变化的便捷工具。
核酸的手性有三个来源：糖分子、二级结构的螺旋性，以及DNA在环境中长程的三级有序排列5,6。核酸的圆二色光谱通常在190至300 nm范围内记录5,6。与蛋白质类似，每种DNA构象都会产生特征性的光谱，尽管由于溶剂条件和DNA序列的差异，其峰/带位置可能在一定程度上有所变化7。最常见的B型DNA以在260–280 nm处的正峰和在约245 nm处的负峰为特征6。B型DNA的峰/带通常较弱，因为碱基对垂直于双螺旋轴，导致分子整体手性较弱。A型DNA在260 nm处呈现一个显著的正峰，在约210 nm处有一个负峰6。Z型DNA是一种左手螺旋，在290 nm处呈现负带，在约260 nm处出现正峰6。该型DNA还在205 nm处表现出极强的负峰6。
除了这些构象外，DNA 还可以形成三链结构（triplexes）、四链结构（quadruplexes）和发夹结构（hairpins），这些结构均可通过圆二色光谱（CD spectroscopy）加以区分。平行的 G-四链体在 260 nm 处呈现一个显著的正吸收带，而反平行的 G-四链体则在 260 nm 处出现负吸收带，并在 290 nm 处有一个正吸收峰，因此可以很容易地区分这两种四链体结构6。三链体结构不产生特征性的光谱信号8。例如，一段长度为 36 个核苷酸、具有形成分子内三螺旋结构潜力的 DNA，在 Na+ 存在下，其光谱在 240 nm 处显示一个强烈的负吸收带和一个宽泛的正吸收峰；该宽泛的正吸收峰在 266 nm、273 nm 和 286 nm 处均有贡献。相同的寡核苷酸在 Na+ 和 Zn+ 同时存在时，则表现出四个负吸收带（213 nm、238 nm、266 nm 和 282 nm）以及一个位于 258 nm 处的正吸收峰。因此，三链 DNA 的光谱会因盐条件的不同而有所变化8。
除了这些构象外，圆二色光谱（CD）还使得另一种称为X-DNA的DNA结构得以被识别。当DNA序列包含交替的腺嘌呤（adenine）和胸腺嘧啶（thymine）残基时，便会形成X-DNA。X-DNA的CD光谱在250 nm和280 nm处呈现两个负峰。目前关于X-DNA的信息仍十分有限，尽管有推测认为其可能作为正超螺旋的“汇”发挥作用6,9。CD光谱的变化还可揭示配体-蛋白质相互作用的细节，因此已被纳入用于检测药物-蛋白质相互作用的分子方法工具箱中10,11,12,13,14。CD光谱还被用于监测蛋白质折叠过程中二级结构的变化15。类似地，CD光谱也可用于研究配体-DNA相互作用16,17。
因此，圆二色光谱法是一种简便且成本较低的方法，可用于区分不同的DNA构象，但需要使用价格不菲的仪器和软件。该方法具有极高的灵敏度且检测速度快。仅需少量DNA样品即可完成检测，相较于核磁共振（NMR）光谱法这一替代技术更具优势。与配体和底物的滴定实验也易于进行。主要限制在于DNA样品必须高度纯净。建议使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化的DNA。
圆二色谱（CD）光谱所获得的信息主要被用于推断蛋白质的结构特征以及识别不同的DNA构象异构体。在本研究中，CD光谱被用于整合来自一项实验的多个结果 体内 染色质免疫沉淀（ChIP）实验用于确定目标蛋白/预测的转录因子是否能够引起其效应基因启动子区域的构象变化。该合作研究通过预测该转录因子在启动子转录起始位点（TSS）及其邻近区域的转录调控机制，推动了传统圆二色光谱技术的发展。
染色质重塑是一种明确的机制，通过使紧密包装的染色质对各种调控因子（如转录因子、DNA复制组分或损伤修复蛋白）变得可接近，从而调控DNA代谢过程。依赖ATP的染色质重塑蛋白，也称为SWI/SNF蛋白家族，是真核细胞中存在的关键重塑蛋白18,19。系统发育聚类已将SWI/SNF蛋白家族分为6个亚群20：Snf2样、Swr1样、SSO1653样、Rad54样、Rad5/16样和远缘类。本研究关注的蛋白SMARCAL1属于远缘亚群20。该蛋白已被用于通过圆二色光谱法研究其转录调控模式。
大多数ATP依赖性染色质重塑蛋白家族成员已被证明能够以ATP依赖的方式重新定位或驱逐核小体，或介导组蛋白变体的交换21,22。然而，该家族中的一些成员尚未被证实具有重塑核小体的能力，例如SMARCAL1。尽管已有研究显示SMARCAL1可与多线染色体结合，但关于其是否具有核小体重塑能力的实验证据仍缺乏23。因此，有研究推测SMARCAL1可能通过改变DNA构象来调控转录24。圆二色光谱（CD光谱）为此假说的验证提供了一种简便且可行的方法。
SMARCAL1 是一种依赖 ATP 的染色质重塑蛋白，主要作为退火解旋酶发挥作用25,26,27据推测，它可通过重塑DNA构象来调控转录24为了验证这一假设，研究了SMARCAL1在阿霉素诱导的DNA损伤过程中调控基因转录的作用。在这些研究中，使用了SMARCAL1用于 体内 分析与ADAAD 体外 检测方法28,29先前的研究表明，ADAAD能够以依赖于结构但不依赖于序列的方式识别DNA30,31该蛋白质最适于结合具有双链向单链过渡区域的DNA分子（类似于茎环结构DNA），并水解ATP 30,31.
体内实验表明，SMARCAL1 通过结合MYC、DROSHA、DGCR8和DICER的启动子区域来调控其表达28,29。该相互作用区域通过染色质免疫沉淀（ChIP）实验得以鉴定28,29。ChIP 技术用于分析细胞内蛋白质与其同源 DNA 的相互作用，其目的是确定特定蛋白质（如启动子或其他 DNA 结合位点上的转录因子）是否结合于特定的基因组区域。首先使用甲醛将与 DNA 结合的蛋白质进行交联，随后分离染色质。分离得到的染色质通过超声处理或核酸酶消化断裂为约 500 bp 的片段，然后使用针对目标蛋白质的特异性抗体对与 DNA 结合的蛋白质进行免疫沉淀。之后逆转交联，通过聚合酶链式反应（PCR）或定量实时 PCR 对 DNA 进行分析。
ChIP 实验结果提出了一个假设，即 SMARCAL1 可能通过诱导这些基因启动子区域的构象改变来介导转录调控。使用 QGRS mapper 和 Mfold 软件来鉴定这些启动子区域形成二级结构的潜力28,29。QGRS mapper 用于预测 G-四链体结构32，而 Mfold33 则用于分析序列形成如茎环等二级结构的能力。
二级结构分析后，进一步 体外 实验使用从牛源SMARCAL1同源物纯化的重组6X His标签活性DNA依赖性ATP酶A结构域（ADAAD）进行 大肠杆菌34ATP酶活性检测使用ADAAD进行，以确定所鉴定的DNA序列可作为效应分子发挥作用28,29最后，通过圆二色光谱检测ADAAD在DNA分子中诱导的构象变化28,29.
为了证明该蛋白质的ATP酶活性对于诱导DNA分子发生构象变化至关重要，实验中添加了乙二胺四乙酸（EDTA）以螯合Mg+2，或添加了活性DNA依赖性ATP酶A结构域抑制剂新霉素（ADAADiN），后者是SWI/SNF蛋白的特异性抑制剂35,36。该圆二色光谱技术可用于任何已通过染色质免疫沉淀（ChIP）或其他相关检测方法证实能够结合至启动子区特定基因组区域的纯化蛋白质。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Fisher scientific</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>腺苷-5&amp;prime;-三磷酸二钠盐水合物</td><td>Sigmaaldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>CD 石英比色皿</td><td>STARNA</td><td>21-Q-1</td><td></td></tr><tr><td>Chirascan V100 圆二色光谱仪</td><td>Applied Photophysics</td><td>不可用</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物</td><td>SRL</td><td>43272</td><td></td></tr><tr><td>谷胱甘肽 Sepharose 4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-01</td><td>谷胱甘肽亲和层析</td></tr><tr><td>Hellmanex III 清洗液</td><td>Hellma</td><td>9-307-011-4-507</td><td></td></tr><tr><td>L-乳酸脱氢酶</td><td>Sigmaaldrich</td><td>&amp;nbsp;L2625</td><td></td></tr><tr><td>乙酸镁四水合物</td><td>Fisher scientific</td><td>BP215-500</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁六水合物</td><td>Fisher scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>NADH 二钠盐</td><td>Sigmaaldrich</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>磷酸烯醇式丙酮酸单环己胺盐</td><td>SRL</td><td>40083</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钾</td><td>Fisher scientific</td><td>P178-3</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸激酶</td><td>Sigmaaldrich</td><td>P1506</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠无水物</td><td>Fisher scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠一水合物</td><td>Fisher scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HT 微孔板读板仪</td><td>BioTek</td><td>不可用</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Fisher scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr></tbody></table>

利用圆二色光谱研究dna-蛋白质相互作用

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

圆二色光谱（CD光谱）是一种简单且便捷的方法，可用于研究生物大分子的二级结构及其相互作用。近年来，CD光谱技术的进步使得研究人员能够详细探究DNA-蛋白质相互作用以及DNA在不同微环境中的构象动态，从而更深入地理解体内转录调控机制。in vivo 转录发生前，潜在的转录区域周围必须发生解旋。这一过程十分复杂，需要组蛋白修饰、转录因子与DNA的结合以及其他染色质重塑活动的协同作用。利用CD光谱技术，可以研究由调控蛋白（如ATP依赖性染色质重塑因子）引起的启动子区域构象变化，进而促进转录过程。同时，也可监测蛋白质自身发生的构象变化。此外，通过在目标DNA序列中引入突变，还可探讨蛋白质对其靶标DNA的亲和力及序列特异性等问题。总之，这种灵敏且经济的方法所提供的独特见解，有助于预测染色质动态的变化，从而提升对转录调控机制的理解。

ADAAD 能够稳定 MYC 启动子上的茎环样结构 
先前的实验证据表明，SMARCAL1 是 MYC29 的负调控因子。通过 QGRS mapper 对 MYC 基因的 159 bp 长启动子区域进行分析显示，正链具有形成 G-四链体的潜力（表 2）。Mfold 分析表明，MYC DNA 的两条链均可形成类似茎环的结构（表 2）。合成了一个长 34 bp、包含 G-四链体（GECE）的 DNA 序列。GECE 寡核苷酸正链和反向序列的 Mfold 结构如 图 1A、B 所示。
使用6X His-ADAAD进行的...

利用圆二色光谱法描述了ATP依赖性染色质重塑因子与DNA配体之间的相互作用。通过产生的峰分析基因启动子上发生的诱导构象变化，可用于理解转录调控的机制。

利用圆二色光谱研究DNA-蛋白质相互作用

圆二色光谱（CD）是一种简单且便捷的方法，用于研究生物大分子的二级结构及其相互作用。近年来……

该方案使我们能够观察由ATP依赖性染色质重塑蛋白诱导的DNA二级结构变化。DNA结构的改变可与转录调控相关联。这是一种简便且高灵敏度的技术，仅需极少量的纯化DNA即可记录寡核苷酸的结构变化。该方法可用于研究由ATP依赖性染色质重塑蛋白介导的转录调控。首先，新鲜配制缓冲液及其他反应组分的工作浓度，并在反应体系建立前置于4摄氏度保存；随后，使用NADH偶联氧化法测定蛋白质在不同DNA分子存在下的ATP酶活性。在96孔板中混合0.1毫摩尔的ADAAD、2毫摩尔的ATP、10纳摩尔的DNA以及1倍浓度的REG缓冲液，最终体积为250微升。接下来，在37摄氏度的培养箱中孵育反应30分钟，然后使用随酶标仪提供的软件测定NAD+的含量。为测量340纳米处的吸光度，点击NADH检测程序，将96孔板放置在仪器的板架上，然后点击读板按钮以记录吸光度。使用高透光石英比色皿采集CD光谱。使用矩形或圆柱形比色皿。清洁比色皿时，先用清水冲洗数次，然后对装有水或缓冲液的比色皿进行扫描，以检查是否清洁干净。实验反应中应使用经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化的DNA寡核苷酸。快速冷却时，将DNA在加热块上于94摄氏度加热3分钟，然后立即置于冰上冷却。缓慢冷却时，在94摄氏度加热DNA 3分钟后，使其以每分钟1摄氏度的速率冷却至室温。为记录基线光谱，依次在1.5毫升离心管中设置总共五个对照反应。所有反应中均保持反应体积为 300 微升。为记录 CD 谱图，依次在 1.5 毫升离心管中设置共计五个实验反应。为记录扫描，打开气体并启动 CD 圆二色光谱仪。10 到 15 分钟后，打开光源，启动水浴，并将样品池 holder 的温度设置为 37 摄氏度。接着，打开 CD 谱图软件，将温度设为 37 摄氏度，波长范围设为 180 至 300 纳米，每数据点采集时间为 0.5 秒，扫描次数设为 5 次，然后点击 pro data viewer，新建一个文件，并根据实验细节和日期重命名该文件。随后，用移液器混合基线反应和实验反应液，小心地将各反应混合液逐一转移至比色皿中，确保无气泡产生。若进行时间进程实验，将反应体系在37摄氏度下孵育所需时间后，进行扫描。向含有DNA、ATP、镁离子和蛋白质的缓冲液中加入EDTA，以终止ATP水解反应。为完全抑制ATP酶活性，可提高EDTA浓度并延长孵育时间。在软件中从相应的反应中减去基线，并在圆二色光谱软件或数据绘图软件中对数据进行平滑处理，然后绘制波长对平均残基椭圆率的图谱并分析峰形。M-fold 分析显示，MYC DNA 的两条链均可形成类似茎环的结构。此处展示了包含 G-四链体 GECE 的正向和反向 DNA 序列的 M-fold 结构。在无ATP和ADAAD以及有ATP和ADAAD存在的情况下，快速冷却的GECE的圆二色光谱显示，ADAAD诱导出两个正峰，一个位于258纳米，另一个位于210纳米。加入EDTA后，这种构象变化被消除。此时圆二色光谱在210纳米处呈现一个负峰，以及一个在230纳米和250纳米处有峰的宽正带。QGRS mapper 和 M-fold 分析显示，DROSHA、DGCR8 和 DICER 的启动子区域具有形成 G-四链体和茎状结构的潜力。DROSHA 第五对的 CD 光谱显示，ADAAD 在 210 纳米处诱导出一个负峰，在 260 纳米处诱导出一个正峰。该光谱是 A-DNA 的特征。DGCR8 配对一的圆二色光谱在 210 纳米处显示一个正峰，在 260 纳米处显示一个宽的负峰。该光谱是 B 型向 X 型转变的特征。对于 DGCR8 配对七，在 210 纳米和 270 纳米处观察到明显的正峰，在 250 纳米处观察到负峰。该光谱是平行G-四链体DNA结构的特征。最后，对于DICER配对一，观察到在210纳米处有一个正峰，在230纳米和260纳米处有两个负峰。这些峰是A型向X型DNA转变的特征。确保DNA和蛋白质的纯度达到99%或更高。比色皿应保持洁净，基线应低于1毫度。所有试剂均需高纯度，以确保背景信号低于1毫度。

cd-spectroscopy-to-study-dna-protein-interactions

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

CD光谱学研究DNA-蛋白质相互作用

在本视频中，我们介绍了免疫荧光方法，用于观察经辐射处理的细胞核中DNA双链断裂位点处DNA修复蛋白γH2AX和53BP1的定位情况。...

基于免疫荧光的DNA修复蛋白相互作用可视化

本视频演示了利用圆二色光谱（CD）技术研究ATP依赖性染色质重塑蛋白存在时DNA发生的构象变化。在有无ATP水解条件下测得的CD光谱变化表明，ATP对于重塑蛋白诱导结合DNA发生构象改变的能力具有重要作用。...

研究DNA-蛋白质相互作用的圆二色光谱技术

差示扫描荧光法是一种广泛用于筛选小分子文库与蛋白质相互作用的方法。本文介绍了一种简单的方法，可将此类分析扩展至估算小分子与其靶标蛋白之间的解离常数。...

使用差示扫描荧光法测定蛋白质-配体相互作用

本文介绍了一种利用全内反射荧光显微镜（TIRFM），结合位点特异性修饰的λ...

在单分子水平上观察量子点标记蛋白与位点特异性修饰的λ DNA之间的相互作用

我们介绍了一种实验方案和数据分析流程，用于在活细胞中结合现代荧光标记技术，开展活细胞双色荧光互相关光谱（FCCS）与荧光共振能量转移（FRET）联用研究膜受体动力学。...

双色荧光交叉相关光谱法研究活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用及蛋白质动力学

DNA幕是一种高通量单分子成像技术，可提供实时可视化多种蛋白质-DNA相互作用的平台。本实验方案利用DNA幕技术研究Abo1的生物学功能及其分子机制，Abo1是一种来自裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的含溴结构域AAA+...

利用DNA幕技术解析组蛋白组装的分子机制

本文介绍了一种利用基于链霉亲和素的生物层干涉技术（BLI）系统研究DNA-蛋白质相互作用的实验方案。文中概述了使用基本或高级结合动力学方法测定相互作用的平衡结合亲和力（KD）所需的关键步骤和注意事项。...

利用基于链霉亲和素的生物膜干涉技术分析DNA-蛋白质相互作用

本方案描述了一种检测化合物与蛋白质分子结合的独特方法，具有蛋白质样品损耗极小和数据准确性高的优势。...

通过差示扫描荧光法检测CD40蛋白与伞形酮的相互作用

本方案介绍了一种基于荧光显微镜的单分子DNA复制检测方法，可实现实时观察DNA聚合酶与G-四链体结构等障碍物之间的相互作用。...

单分子荧光成像观察DNA聚合酶在G-四链体上的动态行为

本方案详细介绍了DNA本征荧光光谱的样品制备、数据采集和分析操作。...

利用固有对比度对DNA分子进行光谱超分辨率成像

了解圆二色谱技术用于分析ATP依赖性染色质重塑蛋白诱导的DNA构象变化。该方法可高灵敏度检测DNA结构改变，为转录调控机制研究提供重要见解。

利用圆二色光谱研究DNA-蛋白质相互作用

探索更多视频