Name: 体外选择核酸适配体以区分感染性和非感染性病毒 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-07T12:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: 了解体外选择DNA核酸适配体的方法，用于区分感染性与非感染性病毒。该技术无需预先了解病毒结构或序列，可应用于临床诊断和环境监测，为开发便携式病毒检测传感器提供可靠方案。

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我们希望感谢来自芝加哥伊利诺伊大学的劳拉·M·库珀女士（Ms. Laura M. Cooper）和龙立军博士（Dr. Lijun Rong），他们为本实验方案提供了所用的假病毒样本（SARS-CoV-2、SARS-CoV-1、H5N1）；同时感谢来自厄巴纳-香槟伊利诺伊大学罗伊·J·卡弗生物技术中心DNA服务设施的阿尔瓦罗·埃尔南德斯博士（Dr. Alvaro Hernandez）和克里斯·赖特博士（Dr. Chris Wright）在高通量测序方面给予的协助；并感谢卢课题组众多成员在本研究中提供的帮助 体外 筛选与适体表征技术。本研究得到了美国国家科学基金会快速响应研究计划（CBET 20-29215）以及伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校可持续性、能源与环境研究所和伊利诺伊-江苏产业技术研究院（JITRI 23965）种子基金的资助。A.S.P. 感谢PEW拉丁美洲研究员项目提供的经费支持。我们还感谢罗伯特·A·韦尔奇基金会（Grant F-0020）对德克萨斯大学奥斯汀分校Lu课题组研究项目的资助。

作者无任何利益冲突需要披露。

SELEX技术不仅能够筛选出具有高亲和力（pM至nM范围）22,43,44,45的适配体，还能获得具有高选择性且可调控选择性的适配体。通过利用反向筛选策略，可以获得具有挑战性区分能力的适配体。例如，Li研究组已证明能够获得可区分致病性与非致病性细菌菌株的序列21。此外，Le等人鉴定出一种能够区分化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）不同血清型的适配体46。这为将具有独特选择性的适配体分子整合到不同的功能化DNA传感器12,47,48,<sup ...

病毒感染对全球的经济和社会产生了巨大影响，这一点在最近的 COVID-19 大流行中愈发明显。及时且准确的诊断对于治疗病毒感染以及防止病毒传播给健康人群至关重要。尽管目前已开发出多种病毒检测方法，例如 PCR 检测1,2 和免疫分析法3，但大多数现有方法无法判断所检测到的病毒是否具有实际感染能力。这是因为仅存在病毒组分（如病毒核酸或蛋白质）并不能说明完整且具有感染性的病毒存在，这些生物标志物的水平与感染性之间的相关性较差4,5,6。例如，目前基于 PCR 的 COVID-19 检测常用的病毒 RNA，在患者具有传染性的感染初期水平极低，而当患者已康复且不再具有传染性时，RNA 水平仍可能非常高7,8。病毒蛋白或抗原生物标志物也呈现类似趋势，但通常比病毒 RNA 出现更晚，因此对传染性的预测能力更差6,9。为解决这一局限性，已开发出一些能够反映病毒感染能力状态的方法，但这些方法依赖于细胞培养微生物学技术，需要较长时间（数天至数周）才能获得结果4,10。因此，开发能够判断临床或环境样本中病毒是否具有感染能力的新传感器，有助于避免治疗延误和病毒进一步传播。然而，目前极少有方法能够获得可识别完整感染性病毒颗粒并将其与失去感染能力的同种病毒区分开来的传感分子。
在这一背景下，适配体作为一种独特的生物分子工具尤为适用11,12,13,14。适配体是短的单链DNA或RNA分子，具有特定的核苷酸序列，能够形成特定的三维构象，以高亲和力和高选择性识别靶标15,16。它们通过一种称为配体系统进化指数富集（SELEX）的组合筛选过程获得，该过程也被称为体外筛选，是在试管中利用包含1014-1015种序列的大量随机DNA文库进行的17,18,19。在该迭代过程的每一轮中，首先在设定条件下将DNA文库与靶标孵育，施加筛选压力。随后去除未与靶标结合的序列，仅保留能在给定条件下结合的少数序列。最后，通过PCR扩增上一步筛选出的序列，使具有所需功能的序列在文库中的比例得到富集，用于下一轮筛选，并重复该过程。当筛选文库的活性达到平台期（通常在8-15轮后），通过DNA测序分析文库，以鉴定出亲和力最高的优势序列。
SELEX 具有独特的优势，可用于提高对其他相似靶标的特异性识别能力20,21，例如针对病毒的感染状态22。首先，SELEX 可使用多种不同类型的靶标进行筛选，从小分子和蛋白质到完整的病原体和细胞均可应用16。因此，为获得能够结合具有感染性病毒的适配体，可直接使用完整病毒作为靶标，而非病毒表面蛋白19。全病毒 SELEX 能够筛选出特异性结合病毒天然构象的适配体，无需对病毒进行破坏。其次，SELEX 可通过每轮筛选中引入反向筛选步骤，定制化地去除竞争性靶标21,23，例如其他相似病毒或无感染活性的灭活病毒22。在反向筛选过程中，将 DNA 文库暴露于不希望结合的靶标，任何发生结合的序列将被剔除。
在本研究中，我们提供了一种通用的实验方案，可用于筛选出能够结合感染性病毒、但不结合经特定消毒方法灭活后的同种病毒或其他相关病毒的适配体。该方法能够基于病毒表面的功能差异来获得识别分子，而无需预先了解这些差异，因此在新发病原体或研究较少疾病的检测方面具有额外优势。

<table><tbody><tr><td>10% 过硫酸铵（APS）</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>不含钙的1x PBS &amp;和镁</td><td>康宁</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）溶液</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>1610146</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 磁珠</td><td>贝克曼库尔特</td><td>A63880</td><td>DNA 纯化磁珠 - 第 7.2.2 节</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 离心滤过装置</td><td>默克</td><td>UFC501024</td><td>截留分子量 10 kDa</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 离心滤过装置</td><td>默克</td><td>UFC510024</td><td>截留分子量 100 kDa</td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100165</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch 双 48/48 快速反应模块热循环仪</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect 实时荧光定量 PCR 检测系统</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>1855201</td><td></td></tr><tr><td>数字干浴器/金属浴加热器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>65001</td><td>链霉亲和素修饰的磁珠 - 第4.9节</td></tr><tr><td>EDTA 二钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>324503</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock 微量离心管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>Lenti-X p24 快速滴定试剂盒</td><td>Takara Bio USA, Inc.</td><td>632200</td><td>慢病毒定量试剂盒 - 第 3.3.2.1 节</td></tr><tr><td>MagJET 分离架，12 × 1.5 mL 管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MR02</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' PCR板密封膜，带粘合剂，光学级</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td>非紫外吸收</td></tr><tr><td>用于 Ready Gel 预制胶的 Mini-PROTEAN Tetra 电泳槽</td><td>BioRad</td><td>1658004EDU</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 短板</td><td>BioRad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>带有0.75 mm一体式垫片的Mini-PROTEAN间隔板</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>1653310</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学级水</td><td>Lonza</td><td>51200</td><td></td></tr><tr><td>96孔PCR板，高型，无裙边，透明</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>MLP9611</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq DNA聚合酶</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>M0480S</td><td></td></tr><tr><td>Ovation Ultralow v2 + UDI</td><td>Tecan</td><td>0344NB-A01</td><td>高通量测序文库制备试剂盒 - 第7.2节</td></tr><tr><td>PIPETMAN G（100-1000） &amp;micro;升，20-200 &amp;micro;L，2-20 &amp;micro;L 和 0.2-2 &amp;micro;L</td><td>Gilson</td><td>F144059M, F144058M, F144056M, F144054M</td><td></td></tr><tr><td>Purifier Logic+ II级A2型生物安全柜</td><td>Labconco</td><td>4261</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR 测定试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>Q32850</td><td>基于荧光的&amp;nbsp; dsDNA 定量&amp;nbsp; 试剂盒 - 第7.2.3节</td></tr><tr><td>SHARP Classic 低吸附移液器吸头（10 μL，200 μL，1000 μL）</td><td>托马斯科学公司</td><td>1158U43, 1159M44, 1158U40</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 17R 微型离心机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75002440</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>1725201</td><td>qPCR预混液 - 第6.2节</td></tr><tr><td>三(羟甲基)氨基甲烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>管子和超透明盖，8个一排的连排管</td><td>美国科学</td><td>AB1183</td><td>PCR管</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr></tbody></table>

体外筛选适配体以区分感染性与非感染性病毒

In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses

病毒感染对社会具有重大影响；目前大多数检测方法难以判断所检测到的病毒是否具有感染性，从而导致治疗延误并加剧病毒传播。开发能够判断临床或环境样本中病毒是否具有感染性的新型传感器，将有助于解决这一尚未满足的需求。然而，极少有方法能够获得可识别完整且具有感染性病毒、并将其与经消毒处理后失去感染性的同种病毒区分开的传感分子。本文介绍一种利用配体指数富集系统进化（SELEX）技术筛选可区分感染性病毒与非感染性病毒的适配体的实验方案。该方法利用了SELEX技术的两个特点：首先，SELEX可通过反向筛选去除竞争性靶标，例如非感染性病毒或其他相似病毒，从而实现定制化筛选；其次，SELEX可直接以完整病毒作为靶标，而非仅使用病毒表面蛋白等单一组分。采用完整病毒进行SELEX筛选，可获得特异性结合病毒天然构象的适配体，且无需破坏病毒结构。因此，该方法能够基于病原体表面的功能差异来获取识别分子，而这些功能差异无需在实验前预先知晓。

由于DNA适配体可以在试管中通过SELEX技术获得15，因此本SELEX策略经过精心设计，既包含针对完整且具有感染性的完整病毒的正向筛选步骤（即保留能够与感染性病毒结合的DNA分子），也包含针对经特定消毒方法（特别是紫外线处理）灭活后的同种病毒的反向筛选步骤，通过剔除能与非感染性病毒结合的DNA序列来实现特异性富集。该筛选过程的示意图如图1所示。
作为本实验方案的代表性结果，我们选择了针对具有感染性的SARS-CoV-2病毒的适配体筛选。由于操作完整且具有感染性的SARS-CoV-2病毒需要在生物安全三级（BSL3）条件下进行，因此我们转而采用假病毒系统。假病毒是基于一种相对无害的骨架病毒（本研究中为慢病毒HIV）构建而成，通过在其病毒包膜中表达目标病毒的表面蛋白，使其能够模拟目标病毒的表面结构和入侵机制，同时避免操作高致病性人类病原体所带来的风险。重要的是，这些假病毒经过改造，无法持续进行病毒复制25, ...

我们提供了一种通用的实验方案，可用于筛选仅结合具有感染性的病毒、而不结合因消毒方法而失去感染性的病毒或其他类似病毒的适配体。这为在便携式快速检测中确定病毒的感染状态提供了可能。

病毒感染对社会具有重大影响；大多数检测方法在判断所检测到的病毒是否具有感染性方面存在困难，……

本方案描述了如何筛选能够区分感染性病毒与非感染性病毒的DNA适配体，以获得可判断临床或环境样本感染能力的传感分子。该技术可用于获取多种其他病毒（包括新发病毒）的特异性适配体，因其无需预先了解病毒的结构或序列信息。该技术有助于开发适配体传感器，用于临床诊断和环境中感染性病毒的监测，以判断个体是否具有传染性，或评估环境消毒方法是否达到预期效果。筛选可能是一个困难的过程，特别是对于初次接触该技术的研究人员而言。优化PCR条件并通过qPCR监测筛选进程至关重要。本实验操作将由我实验室的研究生Marcos Gramajo进行演示。首先，设计初始的单链DNA（SS-DNA）文库和引物。从商业渠道获取经标准脱盐纯化的DNA寡核苷酸。通过10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化单链DNA文库和引物，随后进行乙醇沉淀。接下来，获取感染性和非感染性病毒的储备液，或按照文稿中所述方法进行制备。为变性单链DNA文库，将10微升浓度为100微摩尔的单链DNA文库与240微升SELEX缓冲液混合。在干浴仪中95摄氏度加热15分钟，然后将离心管置于冰上冷却15分钟。将250微升SS-DNA文库与50微升感染性病毒在SELEX缓冲液中混合，用于正向筛选。室温孵育两小时。然后将400微升1毫摩尔的T20序列加入0.5毫升滤膜中，以阻断非特异性结合位点。将滤膜孵育30分钟。在14,000 G条件下离心10分钟，以去除T20溶液。随后用SELEX缓冲液洗涤滤膜三次，以去除过量的T20序列。接下来，将SS-DNA文库与感染性病毒混合物加入已封闭的100千道尔顿滤膜中，离心以洗去未结合的序列。加入400微升SELEX缓冲液并离心，重复洗涤滤膜三次。保留滤膜中的组分，弃去滤过液。为洗脱结合的序列，更换离心过滤管的收集管，并向滤膜中加入300微升含有8摩尔尿素的SELEX缓冲液。将滤膜在95摄氏度加热15分钟，然后离心以收集含有洗脱序列的穿流液。操作完成后，用10%次氯酸钠溶液清洗材料。接下来，将前一步骤中收集的单链 DNA 感染性病毒溶液加入已封闭的 10 千道尔顿滤膜中，在 14,000 G 条件下离心 15 分钟，弃去滤过液。用 300 微升 SELEX 缓冲液洗涤滤膜三次，通过离心去除尿素，每次均弃去滤过液。将滤膜倒置放入干净的收集管中，离心 5 分钟，回收滤膜中的溶液。使用移液器测量回收溶液的最终体积，并标记为第1A轮样品。取第1A轮样品的90%作为第一轮的模板，在优化条件下进行PCR反应。为利用链霉亲和素修饰的磁珠（MB）回收单链DNA（SS-DNA），将产物分装为每份50 µL，加入含有50 µL磁珠的微量离心管中。室温下轻微振荡孵育30分钟。然后将离心管置于磁力架上以分离磁珠（MB），并用移液器吸除上清液。向离心管中加入200微升结合与洗涤缓冲液，洗涤磁珠两次。随后将离心管从磁力架上取下，轻轻振荡，再通过移液将磁珠重悬于缓冲液中，形成均匀的溶液。将试管再次置于磁力架上，移除上清液。第二次洗涤后，将磁珠重悬于100微升SELEX缓冲液中，95摄氏度加热10分钟。立即把试管放入磁力架，收集含有单链DNA文库的上清液。重复此回收步骤，加入 50 微升 SELEX 缓冲液。测量回收组分的最终体积，并标记为第 1X 轮。为使单链 DNA 文库变性，取第 1X 轮样品的 60%，并与 50 微升 SELEX 缓冲液混合。将样品在干浴中加热，然后将离心管置于冰上15分钟。接下来，在SELEX缓冲液中将变性的单链DNA文库与每种病毒各50微升混合，作为去除非特异性结合的反向筛选步骤，并在室温下孵育1小时。在用离心过滤器阻断非特异性结合位点后，将与病毒溶液孵育过的变性单链DNA文库混合物加入已阻断的100千道尔顿滤膜中。将滤器在14,000 G离心10分钟，收集穿滤液。取300微升组分，与含有100 million拷贝/毫升的50微升感染性病毒混合。室温孵育2小时。按照文中所述，配制标准的qPCR预混液，并对纯化的单链DNA文库进行梯度稀释。运行qPCR以确定阈值循环数。运行结束后，利用标准曲线对第1A轮和第1X轮中的单链DNA含量进行定量。然后，通过将结合的DNA量除以初始DNA量来计算洗脱效率，并绘制洗脱效率随轮次的变化曲线。最后，绘制不同轮次的熔解曲线。对于高通量测序，选择合适的市售试剂盒。制备代表高、中、低富集水平的多轮筛选文库，并为每个文库在接头中使用不同的索引组合，同时制备最终文库。随后将制备好的最终文库送至测序机构。进行测序分析时，测序机构已对序列进行解复用处理。使用命令行程序 Cutadapt 去除测序接头和选择引物。然后使用 FASTX-Toolkit 程序去除低质量序列。接着，利用 FASTX-Toolkit 中的 FASTX_reverse_complement 功能对反向方向的序列文件进行处理，并将其与正向方向的序列文件合并。然后使用内置的 CAT 程序将文件合并为单个文件。利用 FASTAptamer 分析工具包分析不同筛选文库中序列的富集情况。首先，使用 FASTAptamer count 和 FASTAptamer cluster 功能将相似序列归类到同一簇中。接下来，使用 FASTAptamer enrich 功能获取有关序列和聚类富集的信息。根据序列分析获得的富集信息，鉴定候选适配体序列。选择若干适配体序列，并通过结合实验进行初步筛选。在本项分析中，采用qPCR监测针对传染性SARS-CoV-2特异性适配体的SELEX筛选进程。洗脱产量在SELEX的前几轮中逐轮增加，并在第八轮和第九轮趋于稳定。通过比较熔解曲线，观察到高熔解温度峰从77至79摄氏度发生偏移。此外，在最后两轮筛选中观察到一个低熔解温度的峰。图中显示了连续筛选轮次中获得的SARS2 AR10序列每百万读段的相对丰度。SARS2 AR10的预测结构表明其具有有序的二级结构，包含一个茎环区域，可能参与对病毒的识别。一旦获得适配体，便可将其整合到电光传感器等其他类型的传感器中，以开发便携式且快速的病毒检测方法，从而判断病毒的感染性。我们预计，可获得针对病毒不同变异株或血清型的特异性适配体，从而实现对威胁社会最严重变异株的快速监测。

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