Name: 在体外使用 邻 苯二甲醛在培养的哺乳动物细胞中快速定量氧化和还原形式的谷胱甘肽 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 3 min 35 s
Description: 学习使用邻苯二甲醛荧光检测法在体外快速定量哺乳动物细胞中还原型与氧化型谷胱甘肽的方法。该方案无需昂贵设备即可实现多参数分析，为氧化应激研究提供可靠工具。

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本研究由欧洲项目GRACIOUS（GA760840）和SUNSHINE（GA952924）资助。作者还希望感谢所有以各种方式协助本实验方案开发工作的人员。

注意：以下实验方案设计为可与双辛可宁酸（BCA）蛋白测定法及腺苷酸激酶（AK）测定法联合使用，以将样品归一化至相应处理条件。在整个材料准备与使用过程中，操作人员须穿戴适当的防护服装和必要的安全设备，例如Howie实验服、丁腈手套和I类安全眼镜。本方案分为多个阶段。
1. 储存液和工作液的配制
<ol>
	<li>配制100 mM GSH标准品的储备液，溶剂为1 mM HCl（由37% HCl用双蒸水（ddH₂O）配制）2O)) 
	注意：若从高浓度酸（如37% HCl）进行稀释，须在I级生物安全柜中将酸加入水中，确保操作过程正确。</li>
	<li>配制22.35 mM邻苯二甲醛（OPA）的无水乙醇储备液。该步骤需在I级生物安全柜中进行。配制25 mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）的ddH₂O溶液。2O. 此步骤需在Ⅰ级生物安全柜中进行。 
	注意：这三种溶液可在 -20 °C 长达3个月。</li>
	<li>配制 0.01 M 三(2-羧乙基)膦（TCEP）至终体积 500 µL，用于100个孔。制备 100 µL 1 mM GSH 标准品，用 ddH₂O 将 100 mM 原液稀释制得2O.</li>
	<li>使用免疫沉淀（IP）裂解缓冲液，或按下述配方配制：Tris-HCl 394 mg（终浓度 25 mM）、NaCl 877 mg（终浓度 150 mM）、EDTA 29 mg（终浓度 1 mM）、100% NP-40 或 IGEPAL CA-630 1 mL（终浓度 1% V/V）、甘油 5 mL（终浓度 5% V/V）、ddH₂O 定容至 100 mL2O. 轻柔搅拌混合组分，并调节pH至7.4。倒入100 mL容量瓶中，用ddH₂O定容至刻度。2O，定容至 100 mL。经 0.22 μm 滤膜无菌过滤 0.22 µm 过滤并于2-8 °C 长达6个月。 
	注意：裂解液在此检测中会起到污染物/干扰物的作用；因此，指定了上述配方。</li>
	<li>配制 1 L 含乙二胺四乙酸的 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS-EDTA），分别调节至 3 种不同 pH 值：7.2、8.5 和 9.0。可使用市售的含 1 mM EDTA（292.24 mg/L）的 0.1 M PBS 缓冲液，或按以下 10 倍浓缩液（1 L）配方配制：80 g NaCl、2.0 g KCl、14.4 g Na2HPO4，2.4 g KH2PO4，800 mL ddH₂O2加入并混匀；定容至 1 L。将溶液高压灭菌以确保无菌，室温保存，可储存 12 个月。取 10x 储存液配制 PBS 工作液，并加入 EDTA（浓度同前文所述）进行补充。 
	注意：pH 值至关重要；在开始实验方案前，务必确保 pH 值准确。</li>
	<li>使用ddH₂O对1 mM GSH进行1:2倍比稀释2O（1 mM， 500 µM, 250 µM, 125 µM, 62.5 µM, 31.25 µM, 15.625 µM，以及 7.8125 µM）。加入 10 µL 每个浓度的样品加入标准孔中（每孔做复孔）。样品将在裂解缓冲液中进一步稀释，因此最终浓度为原来的1/5th 其原始浓度（200、100、50、25、12.5、6.25、3.125） 1.5625 µM). 
	注意：校准的最终浓度将为 30 µm,15 µm,7.5 µm, 3.75 µm, 1.875 µm937.5 nm、468.8 nm 和 234.4 nm。</li>
</ol>
2. 检测准备
注意：本方案使用的人源细胞系 HepG2、A549 和 J774 均购自 ATCC。这些细胞系的使用遵循了该大学关于动物与组织培养的法规和批准指南。
<ol>
	<li>在开始实验前 24 小时，按照 表 1 所示浓度接种细胞；但根据所用细胞系/类型及处理方式的不同，可酌情调整接种密度。使用完全培养基（含 10% 热灭活胎牛血清（HIFS）、1% 青链霉素（10,000 U/mL 青霉素 / 10 mg/mL 链霉素）和 1% 非必需氨基酸的改良伊格尔培养基（EMEM））培养细胞。</li>
	<li>采用常规细胞接种方法接种细胞32。若无需进行实验后显微镜观察，可将细胞接种于全黑培养板中。使用前通过显微镜检查 T75 培养瓶中细胞的融合度及总体状态。</li>
	<li>在洁净、无菌的 II 级生物安全柜中，严格遵循无菌操作技术，弃去细胞培养基，用约 15 mL 无菌室温（RT）磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤细胞，随后弃去 PBS。</li>
	<li>向细胞培养瓶中加入 5 mL 无菌 1× 胰蛋白酶溶液，轻轻摇动以确保完全覆盖细胞单层，然后置于 37 °C 培养箱中孵育 5 分钟，以促进细胞脱落。</li>
	<li>通过加入含热灭活胎牛血清（10%）的生长培养基（约 10 mL）终止胰蛋白酶消化作用。</li>
	<li>将细胞转移至 50 mL 离心管中，在 200 × g 条件下离心 5 分钟形成细胞沉淀。弃去上清液，并替换为 5 mL 相同培养基。充分重悬细胞，直至悬液均匀且无明显细胞团块。</li>
	<li>取 20 µL 细胞悬液置于血细胞计数板中进行细胞计数。根据所需细胞数量计算后，进行适当稀释，制备成目标细胞密度的悬液。</li>
	<li>将含细胞的培养基以每孔最大 200 µL 的体积加入 96 孔板（容量为 350 µL），并将细胞置于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 24 小时，使细胞充分贴壁。</li>
	<li>为同时检测总谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽（GSSG），需对两种条件分别进行处理。每种条件接种并处理 6 个孔，以获得各含 3 个技术重复的两组 GSH 和 GSSG 样本（图 1 展示了实验布局）。</li>
	<li>在实验开始前确保所有试剂均已正确配制；除 pH 7.4 的 PBS（不含 EDTA）应保持在冰上或冷藏保存直至使用外，其余缓冲液组分和试剂均应在配制缓冲液或用于实验前恢复至室温。 
	注意：必须尽可能减少气泡产生，以确保实验体系中发生预期反应，并通过酶标仪实现准确的定量检测。</li>
</ol>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>细胞系</td>
			<td>接种密度（96孔板）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2</td>
			<td>10,000 个细胞 / 孔</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>5,000 个细胞 / 孔</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J774</td>
			<td>10,000 个细胞 / 孔</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：选定细胞系的建议接种密度。 展示了在本研究数据中使用的三种不同细胞系（A549、J774和HepG2）的不同接种密度。
<img alt="GSH 和 GSSG 比色法检测板设计；样品分析与结果校准示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66267/66267fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：用于同时测定总谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的96孔板接种建议布局。 图中同时展示了用于校准和对照的孔位。未使用的孔位以叉号表示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66267/66267fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 纳米材料处理
<ol>
	<li>称量纳米材料（特别是ZnO、TiO₂）2，CuO 和 Ag）在一种 µg 可称量的电子天平。进行计算，以获得每种纳米材料初始浓度为 1 mg/mL。</li>
	<li>将纳米材料溶液转移至超声波清洗器中，使用超声波浴（38 W）超声处理16分钟，以获得均匀的溶液。对每种纳米材料分别进行系列稀释，浓度分别为125、62.5、31.25， 15.625 µg/mL.</li>
	<li>从培养箱中取出细胞，用室温 PBS 轻柔洗涤。确保完全去除 PBS 后，加入 100 µL 处理组与对照组（不含HIFS的培养基）分别加入培养板中。对细胞施加处理后，在37℃下与纳米材料共同孵育°C 培养箱（5% CO₂）2）孵育4小时；之后，采用以下方案定量检测GSH:GSSG、蛋白质浓度和AK释放量。</li>
</ol>
4. 检测方案
<ol>
	<li>处理暴露后（图2A），通过腺苷酸激酶（AK）活性评估细胞活力（可选步骤）。使用商用试剂盒，并按照制造商说明书进行该检测。</li>
	<li>将培养板在离心机中以200 × g 离心5分钟，使处理物和细胞碎片轻微沉淀（图2B）。</li>
	<li>从每个样品及对照孔（如上所述）中轻柔吸取20 µL培养基上清液，并按相同布局转移至相邻的96孔白色培养板中（图2C）。</li>
	<li>向每孔加入100 µL AK试剂盒的工作液，避光孵育，在室温下反应10分钟。使用酶标仪以每秒1000计数记录发光信号。</li>
	<li>对于谷胱甘肽（GSH）标准品，向每孔加入40 µL总谷胱甘肽缓冲液（图2D；可选，定量所需）。</li>
	<li>吸除培养板中剩余的培养基，用预冷的0.1 M PBS（pH 7.2）洗涤3次，每次洗涤液均弃去（图2E），标准品孔除外。最后一次洗涤后保留PBS于板中，直至完成GSH标准曲线加样。</li>
	<li>将不同浓度的谷胱甘肽溶液及空白对照（ddH2O）各取10 µL，每组设三个复孔加入相应孔中。</li>
	<li>移除最后一次PBS洗涤液，根据表2所示向各孔加入相应混合液，以实现目标物的定量检测（图2E）。由于完整缓冲液体系中活性会随时间迅速丧失，应在开始此步骤前预先计算所需体积。确保这些试剂混合液在实验开始前配制完成，但配制后不得超过30分钟即投入使用。</li>
	<li>将培养板置于轨道振荡器上，以300 RPM振荡2分钟（图2F）。</li>
	<li>从振荡器上取下培养板，向除NEM对照孔外的每孔加入5 µL 0.01 M TCEP溶液，再将培养板放回振荡器，孵育10分钟（图2F）。</li>
	<li>将培养板转移至离心机，以200 × g 离心5分钟。从每个样品孔中转移25 µL液体至另一块96孔透明培养板中；该部分样品将用于蛋白浓度测定（见步骤4.15；图2G）。标准品孔和检测对照孔无需转移。</li>
	<li>确保每孔最终体积为30 µL；通过移除部分液体使对照孔和标准品孔达到该体积要求（图2H）。</li>
	<li>向每孔加入170 µL OPA工作液，避光后置于振荡器上振荡15分钟（图2I）。</li>
	<li>使用酶标仪在激发波长340 nm、发射波长450 nm（Ex340/Em450）条件下检测荧光强度（图2J）。测量过程中应确保无气泡存在，否则将对反应及酶标仪定量结果产生不利影响。</li>
	<li>为定量裂解细胞中的蛋白含量，使用商用BCA蛋白检测试剂盒。将步骤4.12中保留的样品各取25 µL转移至新的96孔透明培养板中，每孔25 µL。</li>
	<li>使用IP裂解缓冲液稀释的牛血清白蛋白（BSA）标准品，每孔加入25 µL，设三个复孔。具体浓度参照BCA试剂盒说明书设定。</li>
	<li>按BCA试剂盒中试剂A与试剂B以50:1的比例配制工作液，向含样品、标准品和对照的每孔加入200 µL。避光后于37°C孵育30分钟（图2K）。</li>
	<li>从孵育箱中取出样品，室温平衡5分钟，然后使用酶标仪在562 nm波长下检测吸光度（图2L）。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2"> 总谷胱甘肽浓度裂解试剂混合液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>裂解缓冲液</td>
			<td>50µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>每孔总体积</td>
			<td>50µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">氧化型谷胱甘肽浓度裂解试剂混合液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>裂解缓冲液</td>
			<td>49.5µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEM (25mM)</td>
			<td>0.5µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>每孔总体积</td>
			<td>50µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">两种溶液均需在配制后30分钟内使用</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPA检测溶液组分</td>
			<td>体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPA 3mg/mL</td>
			<td>5µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (pH 9.0)</td>
			<td>165µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>每孔总体积</td>
			<td>170µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：执行本方案所需的试剂体积。 每孔测定总谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽及工作试剂所需的体积。请确保已计算所需体积，并额外增加一定量以补偿移液过程中的体积损耗。
<img alt="细胞处理实验流程图，包含离心、培养基转移、BCA蛋白分析及GSH/GSSG定量。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66267/66267fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：实验方案的示意图。 (A细胞的初始接种、培养与处理。B离心以分离悬浮固体与培养基。C) 腺苷酸激酶检测的培养基转移。D) 加入用于校准范围的谷胱甘肽浓度。E洗涤步骤及裂解试剂添加。F缓冲液添加与三(2-羧乙基)膦添加并进行振荡步骤。G) 裂解细胞离心以去除培养基，用于蛋白质分析。H) 移除培养基以使各孔体积相等。I) 添加 正交-邻苯二甲醛工作液，振荡孵育。J测量 正交-邻苯二甲醛荧光检测，使用酶标仪。K) 蛋白质测定中双辛可宁酸法的孵育阶段。L) 蛋白质浓度测定，用于谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽比值的归一化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66267/66267fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

GSH/GSSG Measurement &#8211; A Refined OPA Assay for Antioxidant Research

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</ol>

作者声明无利益冲突。

如前所述，理解细胞氧化还原状态、监测氧化应激水平以及抗氧化反应，对于认识和预防多种疾病（如癌症和神经退行性疾病）始终至关重要33,34。本文展示了一种改进翻译研究领域的方法，即通过快速、最少样品前处理的方式，提高准确检测GSH:GSSG的可及性。
本方案展示了一种多参数检测流程，用于测定细胞内谷胱甘肽/硫醇类物质（还原型与氧化型），并通过BCA蛋白检测和/或AK检测两种方法进行归一化。该检测方法还可通过初始介质提取步骤进行调整，以检测多种其他标志物；亦可简化流程，仅获得氧化型/还原型硫醇比例，而无需标准曲线校准。
在考虑分析物的检测时，对mBCI和OPA两种方法进行了探索和比较。尽管mBCl最初表现出良好的信号潜力，但在实际应用中发现了显著的局限性。主要问题是，mBCl的最佳使用依赖于活细胞；然而，在细胞裂解后，其信号被发现受到淬灭，且在多孔板体系中的信号强度通常较OPA弱35。另一个问题是通过mBCl检测GSSG，目前相关文献报道较少，且经过实验方案的优化和探索，仍未能实现对GSSG的准确定量检测。
我们已证明，OPA 法具有显著可靠的校准范围，在 0.234 - 30 µM GSH 浓度范围内，R2 平均值为 0.9932 ± 0.007（N=12）。选择该范围是基于文献中先前报道的参考范围35。理论上可检测超出此范围的谷胱甘肽，但需调整试剂浓度、孵育时间，以及可能涉及的检测设备。需要注意的是，每块微孔板均需建立独立的标准曲线用于定量；在不同日期进行实验时，各板之间操作时间的微小差异均可能对测量结果产生显著影响。
从本实验方案中获得准确且可靠的数据，取决于严格遵守若干关键步骤。在配制本方案所需的各种缓冲液时，必须确保pH值准确无误。因此，要求pH为9的缓冲液，其偏差不得超过±0.1。这是因为缓冲液组分在不合适的pH条件下可能从溶液中析出沉淀；严格按照本方案操作可避免此问题。
在裂解前彻底去除处理物并准确洗涤，对于防止在读板阶段出现干扰和数据采集不准确也至关重要。一旦细胞已被裂解（步骤4.8），便无法再去除处理物，此时微孔板将无法挽救。由于在整个实验方案中加入的缓冲液/试剂体积在样品与标准品之间有所不同，因此操作者必须清楚了解步骤4.12和4.13中这些体积的差异。实验操作人员需注意这些不同的体积，并被明确要求确保所有体积保持一致，以实现准确测量。由于样品与标准品之间的体积差异在肉眼观察下并不明显，因此很容易在样品孔中残留过量溶液而造成操作失误。
本方案存在一些依赖关键步骤的局限性，这些步骤对于获得准确可靠的数据至关重要。操作本实验的人员需具备合理的实验技能水平，以避免出现气泡形成等非预期问题。气泡的形成会显著影响微孔板内反应的发生能力以及荧光信号的检测。本方案所使用的裂解试剂含有去污剂，这可能对初学者研究人员造成困难，使其难以避免气泡产生。若出现该问题，立即进行离心可能挽救此误差。此外，本方案在细胞类型方面也可能存在局限性；A549、J774 和 HepG2 细胞系被用于本方案的优化及数据生成。其他细胞系可能需要不同的接种密度并对方案进行优化，才能获得准确的数据。
本方案相较于现有的多种检测方法具有诸多优势。虽然使用邻苯二甲醛检测巯基并非全新概念，但将其应用于本方案所采用的微孔板联合检测体系中，并且所需材料和设备有限，这使得所有实验室均可便捷地实施该方法。目前多数商业供应商提供的巯基/谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒均未公开其试剂的具体组分，因此难以预判可能存在的不相容性或干扰因素。本文中，我们列出了所用试剂的全部组分，以最大限度降低此类风险。
在完成初始处理阶段后，该方案的执行也相对较快。考虑到孵育阶段之间用户的操作时间，本方案中的巯基定量部分可在1小时以内完成。样品同时进行裂解和结合，以防止样品发生自氧化，这对于这些反应物种而言是最佳条件。尽管本方案未明确说明，但从技术上讲，样品可在微孔板中裂解并密封，以便冷冻保存用于后续分析。然而，这种对方案的修改尚未经过研究验证。

活性氧（ROS）是氧化应激的主要诱因；已有充分证据表明，氧化应激在DNA突变、细胞衰老/死亡、多种癌症、糖尿病、神经退行性疾病（如帕金森病和阿尔茨海默病）以及其他多种严重影响生命的疾病中发挥重要作用1,2,3,4,5。对抗活性氧的关键防御机制之一是含巯基的非酶抗氧化剂，这类物质可通过作为质子供体来还原氧化剂或自由基6,7。谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸是哺乳动物体内含量最丰富的两种巯基化合物8，尽管还存在其他多种低分子量巯基化合物（如麦角硫因），但在文献中报道最多的非酶抗氧化剂仍是GSH和半胱氨酸9,10,11，且它们在抵抗活性氧方面具有最重要的生理意义8,12,13,14。
当谷胱甘肽（GSH）作为抗氧化剂被利用时，两个GSH分子通过二硫键共价连接，形成氧化型谷胱甘肽（GSSG）。GSH的耗竭常被用作氧化应激的指标15,16。该评估也可与GSSG的检测相结合，尽管细胞内GSSG的增加通常受到主动外排过程的限制，因为GSSG在细胞内具有较高的反应活性，可能导致与其他蛋白质巯基形成二硫键16。
传统的GSH和GSSG检测方法并不简单，需要多个步骤，包括使用裂解试剂进行细胞提取17,18。本文所述方案简化了这些方法，可准确测定非酶促性硫醇，并利用细胞蛋白含量或腺苷酸激酶释放量进行归一化。此外，在提取GSH/GSSG之前还可测定细胞活力。此前已有多种方法尝试高效地靶向并定量还原态与氧化态的非酶促性硫醇，包括高效液相色谱法（HPLC）19,20,21、微孔板检测法（生化法）22,23,24,25，以及使用常见的硫醇偶联试剂，如5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB/Elman试剂）19、单氯二苯并呋喃（mBCI）26,27,28。一些公司也开发了专有的谷胱甘肽检测试剂盒；然而，这些试剂盒未公开试剂的不相容性信息，这在特定处理条件下可能带来问题29。
本方案概述了一种多参数检测方法，该方法通过邻苯二甲醛（ortho-phthalaldehyde, OPA）与巯基（如GSH）发生偶联反应，产生可在340/450 Ex/Em处检测的荧光信号，从而检测还原型硫醇。本检测方法可在同一微孔板中同时检测GSH和GSSG，通过使用掩蔽剂（N-乙基马来酰亚胺）和GSSG还原剂（三(2-羧乙基)膦）实现。该多生物标志物检测方案还可在细胞裂解阶段，利用二辛可宁酸法（bicinchoninic acid assay）对蛋白进行定量，以便在最终检测完成后对样品进行归一化处理；或通过检测细胞培养基中的腺苷酸激酶活性进行归一化。该检测可使用大多数实验室中常见的多种试剂完成，仅需少量非常见化学品。整个流程简便易行，无需繁琐步骤，可在2小时以内完成。
在本实验方案中，选择了多种纳米材料，这些材料此前已被证明或怀疑可诱导活性氧（ROS）产生或引起氧化应激30,31。通过探索不同浓度范围，以观察这些纳米材料对多种细胞系的影响，以及该检测方法在定量抗氧化性硫醇方面的有效性。

<table><tbody><tr><td>0.22&amp;micro;m 滤膜（可选，用于裂解缓冲液）</td><td>Fisher scientific</td><td>12561259</td><td></td></tr><tr><td>100 mL 容量瓶</td><td>Fisher scientific</td><td>15290866</td><td></td></tr><tr><td>1 L 容量瓶&amp;nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>15230876</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 烧杯（可选，用于裂解缓冲液）</td><td>Fisher scientific</td><td>15409083</td><td></td></tr><tr><td>8通道移液器（20–200 &amp;micro;L）</td><td>SLS</td><td>FA10011D2</td><td></td></tr><tr><td>8通道移液器（2–20 &amp;micro;L）</td><td>SLS</td><td>B2B06492</td><td></td></tr><tr><td>96孔板——黑色板体，透明底，经组织培养（TC）处理</td><td>Fisher scientific</td><td>10000631</td><td>推荐用于细胞接种和荧光检测；若不可用，则使用经TC处理的透明板</td></tr><tr><td>96孔板——透明（经或未经TC处理）</td><td>Fisher scientific</td><td>10141161</td><td>若无黑色透明底板，或其不适用，则使用经TC处理的透明板</td></tr><tr><td>96孔板——白色，未经TC处理</td><td>Fisher scientific</td><td>11457009</td><td></td></tr><tr><td>A549（肺癌）细胞系</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>1.08543</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Fisher scientific</td><td>11779408</td><td>用于保护板免受光照</td></tr><tr><td>BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Thermo</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机（配备96孔板转子）</td><td>Eppendorf</td><td>5804</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>谷胱甘肽（GSH）</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>G6013</td><td></td></tr><tr><td>氧化型谷胱甘肽（GSSG）</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>G4501</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HCl，37%</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>258148</td><td>稀释至1 mM用于GSH储备液，也可用于pH调节</td></tr><tr><td>HepG2（肝癌）细胞系</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL&amp;nbsp;CA-630&amp;nbsp;</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>18896</td><td>溶液中使用IGEPAL CA-630或NP-40之一，不可同时使用两者</td></tr><tr><td>IP裂解缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>11825135</td><td></td></tr><tr><td>J774（单核细胞/巨噬细胞）细胞系</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>移液器（20–200 &amp;micro;L）</td><td>SLS</td><td>B2B06482</td><td></td></tr><tr><td>移液器（2–20 &amp;micro;L）</td><td>SLS</td><td>B2B06478</td><td></td></tr><tr><td>微孔板振荡器</td><td>VWR</td><td>444-0041</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH，10 M</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>72068</td><td>仅用于pH调节</td></tr><tr><td>N-乙基马来酰亚胺（NEM）&amp;nbsp;</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>E3876</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>492016</td><td>溶液中使用IGEPAL CA-630或NP-40之一，不可同时使用两者；建议使用NP-40作为替代</td></tr><tr><td>邻苯二甲醛（OPA）</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>P1378</td><td></td></tr><tr><td>PBS 0.1 M</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>P2272</td><td>PBS可购买预配制溶液，也可自行配制，详见说明</td></tr><tr><td>酶标仪（具备荧光检测功能）</td><td>Tecan</td><td>SPARK</td><td></td></tr><tr><td>搅拌子（可选，用于裂解缓冲液）</td><td>Fisher scientific</td><td>16265731</td><td></td></tr><tr><td>Toxilight 生物检测试剂盒（AK 检测）</td><td>Lonza</td><td>LT17-217</td><td></td></tr><tr><td>三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）0.5 M&amp;nbsp; 水溶液（H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>Alfa Aesar</td><td>H51864</td><td>也可购买结晶形式后溶于水使用</td></tr><tr><td>TRIS-HCl</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>93363</td><td></td></tr><tr><td>100倍磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合液&amp;nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>10025743</td><td></td></tr></tbody></table>

快速定量测定谷胱甘肽氧化态与还原态的方法 正交 -在体外培养的哺乳动物细胞中使用邻苯二甲醛

Rapid Quantification of Oxidized and Reduced Forms of Glutathione Using Ortho -phthalaldehyde in Cultured Mammalian Cells In Vitro

谷胱甘肽长期以来被视为确定细胞抗氧化反应的关键生物标志物，因此是活性氧研究中的主要指标。本方法利用邻苯二甲醛（Ortho-phthalaldehyde, OPA）来定量细胞内谷胱甘肽的浓度。OPA 通过与还原型谷胱甘肽（GSH）的巯基结合，形成异吲哚环结构，从而生成高度荧光的共轭产物。为了准确测定氧化型谷胱甘肽（GSSG）和 GSH 的含量，需要结合使用掩蔽剂和还原剂，本实验方案中已包含这些试剂。处理因素还可能影响细胞活力，因此本多参数检测方法中提供了通过蛋白定量进行归一化的步骤。该检测方法对 GSH 的检测呈伪线性关系，检测范围为 0.234 - 30 µM（R2 = 0.9932 ± 0.007（N = 12））。本检测方法还可通过添加掩蔽剂 N-乙基马来酰亚胺（N-ethylmaleimide）结合还原型谷胱甘肽，并引入还原剂三(2-羧乙基)膦（tris(2-carboxyethyl) phosphine）断裂 GSSG 中的二硫键，生成两分子 GSH，从而实现对氧化型谷胱甘肽的测定。该检测方法可与已验证的双辛可宁酸（bicinchoninic acid）蛋白定量法以及腺苷酸激酶细胞毒性检测法联合使用。

按照本方案，A549 和 J774 细胞系分别以 5,000 个细胞/孔和 10,000 个细胞/孔的密度接种，并在 37 °C、5% CO2 条件下培养 48 小时。纳米材料处理后的腺苷酸激酶（AK）分析结果见补充表 1，蛋白浓度结果见补充表 2。
标准曲线图 
图3展示了在三个不同且非连续的日期，使用三种不同细胞类型（尽管不应影响标准曲线）的三个独立培养板，按照所述浓度范围（0.234 - 30 µM 终浓度）进行的三次标准曲线测定。虽然图中仅显示了3个样本，但实际观察到的样本数（N）为12，均表现出相似的线性回归，平均R2值为0.9932 ± 0.007。
<img alt="GSH浓度与荧光关系图；包含校准曲线分析的方程式。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66267/66267fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：检测用谷胱甘肽校准曲线图。 三个独立的板内谷胱甘肽校准范围所绘制的校准曲线图，每次实验间隔一周；误差条表示±标准差（n=3，N=12），其中n为技术重复次数，N为生物学重复次数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66267/66267fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
示例结果 
HepG2、A549 和 J774 细胞被用于评估多种疑似通过氧化应激诱导细胞机制变化的纳米材料。采用上述检测与定量方案进行分析。
来自三项检测（AK、BCA 和 GSH/GSSG）的数据处理方式如下。AK 和 BCA 检测用于归一化；使用推荐试剂盒的 AK 检测可快速、简便地获得释放到细胞培养基中的腺苷酸激酶（AK）含量数据。随着细胞死亡程度增加，AK 值预期会上升。因此，需要设置阴性对照（活细胞）和阳性对照（死细胞），以便基于百分比进行归一化。
BCA 法是一种耗时较长的检测方法，但可通过蛋白质定量（mg/mL）获得可量化的结果。该方法不需要像 AK 检测那样的阴性或阳性对照，但仍需设置常规阴性对照（未处理细胞），以便对数值进行归一化处理。
在本代表性结果部分中，发现处理因素（纳米材料）可能对AK检测产生干扰。因此，所有归一化均基于BCA检测数据进行。故此处信息表示为每毫克/毫升蛋白质（通过BCA法测定）中检测到的目标物质浓度（GSH或GSH+GSSG；然而，GSSG浓度是通过从总GSH+GSSG浓度中减去GSH浓度而获得）。如有需要，可进一步将该数据转换为GSH:GSSG比值，以评估特定处理条件下GSH与GSSG比例的变化。
图4展示了使用OPA方法测定的三种不同细胞系（A549、J774和HepG2）的GSH:GSSG比值数据，并通过BCA法（µg/mL）以蛋白表达量进行归一化处理；更多关于GSH和GSSG具体数值的补充数据见补充图1。
<img alt="谷胱甘肽比例图；GSH:GSSG 与纳米材料浓度的关系；CuO、Ag、ZnO、TiO2 分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66267/66267fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：通过检测得到的谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽（GSH:GSSG）比值。 图中显示了三种细胞系的谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽（GSH:GSSG）比值，分别为（A）A549、（B）J774 和（C）HepG2。细胞在无血清培养基中与不同处理（各种纳米材料）共同孵育4小时，随后使用本方案处理细胞，以定量检测谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的变化，并通过蛋白质定量进行归一化。误差线表示标准误（± SE），n=3，N=3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66267/66267fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
该孔板还包含一系列对照，以确保检测反应正常进行。NEM 作为单独组分加入，用于证明其与 OPA 检测试剂无相互作用。校准标准品显示出随 GSH 浓度增加而呈线性上升的信号，表明 OPA 检测试剂能够有效结合不同浓度的 GSH，具备良好的检测能力。
需要注意的是，该检测方法特异性靶向硫醇中常见的游离巯基（例如谷胱甘肽GSH，通常被认为是抗氧化剂）。一个潜在的干扰因素是邻苯二甲醛（OPA）与蛋白质中的巯基结合，这将导致数据采集不准确。因此，BCA检测是归一化蛋白质数据的关键步骤，可准确反映游离GSH的含量。
补充图1： 显示三种细胞系——即（A）A549、（B）J774 和（C）HepG2 中谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽以及谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽比值的图示。细胞在无血清培养基中与不同处理物（各种纳米材料）共同孵育4小时，随后采用本方案处理细胞，以定量检测谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的变化，并通过蛋白质定量进行归一化，误差条表示±标准误（n=3，N=3）<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66267/Supplemetary%20Figure%201_RE.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 1：A549 和 J774 细胞腺苷酸激酶值的元数据。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66267/Supplementary%20data%201_AK%20values_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 2：A549、J774 和 HepG2 细胞的二辛可宁酸法（BCA）校准值元数据。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66267/Supplementary%20data%202_BCA%20values_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

通过使用邻苯二甲醛（Ortho-phthalaldehyde, OPA）可实现对谷胱甘肽的氧化型与还原型（分别为GSSG和GSH）的定量检测。OPA与GSH结合后会发出强烈荧光，但无法与GSSG结合，除非先将GSSG还原。本文介绍了一种多参数检测方法，利用蛋白质定量进行归一化，以同时定量检测这两种形式。

谷胱甘肽长期以来被视为确定细胞抗氧化反应的关键生物标志物。因此，它是衡量活性氧……的主要指标

我们旨在提供一种定量测定硫醇浓度的新方法，特别关注可在原位进行的不同细胞系中GSH和GSSG浓度的检测。我们认为该方案对科学界具有实用价值。目前已有大量研究致力于检测活性氧相关的特定生物标志物。此外，许多研究者对检测短寿命的活性氧物种表现出浓厚兴趣，例如自由基以及羟基和单线态氧等小分子。对于多个研究机构而言，一个关键挑战在于能否在无需昂贵设备或繁琐流程的情况下，准确且特异性地检测目标生物标志物。本实验方案支持多参数分析，可在无需单独进行其他实验步骤的情况下实现数据的标准化。并去除其他检测方法中存在的多个步骤，这些步骤通常耗时较长、试剂不兼容或使用对健康有害的试剂。纳米材料安全小组将继续评估各类纳米材料和聚合物对人类健康可能产生的影响。我们认为本方案是实现这一目标的重要工具之一，因为该方案有望通过多重检测来识别更多的生物标志物。首先，准备好进行检测所需的所有材料。对于谷胱甘肽（GSH）标准品，向每个孔中加入40 µL总谷胱甘肽缓冲液。接着，从含有细胞沉淀的培养板各孔中吸去培养基，并用预冷的PBS洗涤细胞三次。使用10微升谷胱甘肽和双蒸水作为空白对照，设置三份平行样制备标准曲线。为实现目标定量，将洗涤后的细胞与适当混合液在300 RPM的摇床中孵育2分钟。然后向每孔加入5微升0.01摩尔的Tris(2-羧乙基)膦溶液，并再次孵育10分钟。接下来，将培养板在200 G条件下离心5分钟。然后从每个样品孔中转移25微升至一个新的透明96孔板中，用于蛋白质定量。随后，向每个含有30微升样品的孔中加入170微升工作浓度的邻苯二甲醛溶液。为防止光线照射，用铝箔完全覆盖培养板，并在轨道摇床中孵育15分钟。最后，使用酶标仪在340纳米激发波长和450纳米发射波长下读取荧光信号。在此检测中，经不同纳米材料处理的A-549细胞显示出不同的谷胱甘肽二硫化物比率。而用每毫升125微克银处理的细胞表现出最高值。

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科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

在体外使用 邻 苯二甲醛在培养的哺乳动物细胞中快速定量氧化和还原形式的谷胱甘肽

本文提出了一些简单的方法，用于检测和评估细胞中活性氧的存在。...

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我们介绍一种通过过氧化氢（H2O2）处理视网膜色素上皮细胞以建立和使用氧化应激模型的实验方案，用于分析细胞形态、活力、密度、谷胱甘肽水平及UCP-2表达水平。该模型可用于研究转座子转染细胞所分泌蛋白对神经视网膜变性的抗氧化作用。...

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蛋白质巯基氧化在正常生理和病理生理条件下具有重要意义。本文详细描述了一种定量氧化还原蛋白质组学方法，该方法利用树脂辅助捕获、等重标记和质谱技术，能够实现对蛋白质中可逆氧化半胱氨酸残基的位点特异性鉴定与定量分析。...

树脂辅助捕获联合等重串联质谱标签标记用于多重定量蛋白质硫醇氧化

本文介绍了一种利用共聚焦活细胞显微镜检测原代海马神经元和皮层神经元基础氧化还原状态差异以及对急性干扰的氧化还原反应差异的实验方案。该方案经少量修改后也可适用于其他细胞类型和显微镜系统。...

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本文提出了一种系统化、易于操作且可重复的实验方案，用于通过2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯探针（DCFH-DA）检测穆勒胶质细胞（MGCs）中的细胞内活性氧（ROS）。该方法利用流式细胞仪对细胞内总活性氧水平进行定量分析。本方案操作简便，适用性强，且具有良好的可重复性。...

使用2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯探针和流式细胞术定量穆勒胶质细胞中的活性氧物种

学习使用邻苯二甲醛荧光检测法在体外快速定量哺乳动物细胞中还原型与氧化型谷胱甘肽的方法。该方案无需昂贵设备即可实现多参数分析，为氧化应激研究提供可靠工具。

快速定量测定谷胱甘肽氧化态与还原态的方法正交 -在体外培养的哺乳动物细胞中使用邻苯二甲醛

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